摘 要：小肠结肠炎耶尔森氏菌是重要的食源性致病菌，如何有效地检测该菌是预防和减少食品安全问题的关键环节。本文较为系统地介绍了利用常规分离鉴定、免疫学、分子生物学和生物质谱等技术手段检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，最后对小肠结肠炎耶尔森氏菌检测技术的现状进行分析，并对发展趋势进行了预测。
关键词：耶尔森氏菌；分离鉴定；免疫学技术；分子生物学技术；生物质谱技术
Abstract：Yersinia enterocolitica is an important food borne pathogen， how to effectively detect the bacteria is the key to prevent and reduce food safety issues. This paper systematically introduces the method of using conventional isolation and identification， immunology， molecular biology and biological mass spectrometry techniques to detection of Yersinia enterocolitica systematically， analyses the status of Yersinia enterocolitica detection techniques and predicts the development of future finally. enterocolitis Yersinia enterocolitica， the final status of enterocolitis Yersinia enterocolitica detection technology are analyzed， and the development trend.
Key words：Yersinia； Isolation and identification； Immunological technique； Molecular biology technology； Biological mass spectrometry
中图分类号：TS207.4
小肠结肠炎耶尔森氏菌（Yersinia enterocolitica）是一种广泛分布的细菌，可存在于生鲜蔬菜、乳和乳制品、肉类、豆制品等食品中。它是人畜共患病的食源性致病菌，其多种血清型已被证实带有致病性，可以引起多种肠道疾病，严重者可能致死[1]。因此，很多国家制定了相关检测标准，我国也颁布了相应的国家和检验检疫行业标准。为了提高该菌的检测效率，建立快速特异的检测技术是研究者关注的重点。目前国内外已有不少关于该菌检测技术的研究和报道，本文将综述近年来食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌检测技术的研究进展。
1 常规分离鉴定技术
小肠结肠炎耶尔森氏菌常规分离鉴定技术包括増菌培养、碱处理、选择性分离、改良克氏双糖试验、尿素酶试验、动力观察、革兰氏染色及生化鉴定。也可直接使用生化鉴定系统（API20E或VITEK GNI+），近年来还出现了Micro-ID系统、Enterotube系统和Mnitek系统等生化鉴定系统，使得小肠结肠炎耶尔森氏菌鉴定更快速化、微量化和简易化[2]。目前，常规分离鉴定是国际上检测该菌主要使用的方法，随着新的培养基和生化鉴定系统不断被开发，常规方法的周期将被缩短，检测的准确性也将进一步提高。
2 免疫学检测技术
2.1 酶联免疫吸附技术
酶联免疫吸附技术（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是将抗原（或抗体）进行免疫酶染色，通过底物显色来分析有色产物量，即确定样品中待测物质的含量。ELISA法具有灵敏度高，特异性强，周期短等优点，目前已广泛应用于多个领域。
L. Fernandez-Lago等[3]采用免疫印迹法和ELISA法检测O∶9血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌释放蛋白的免疫应答，结果表明该菌外膜蛋白可以通过感染的途径在体内进行表达，且ELISA法能够检测到含有毒菌株样本中外膜蛋白的免疫应答。
2.2 免疫胶体金技术
胶体金免疫层析技术（Gold immunochroma-tography assay，GICA）是一种多技术结合的固相标记免疫检测技术。该技术操作简便快速、特异性强、灵敏度高、所需仪器试剂少，在食品安全监督和动植物检疫等领域应用广泛[4]。唐浏英等[5]建立一种胶体金标记免疫层析条用于检测标O∶9血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌，结果表明GICA小肠结肠炎耶尔森菌检测条灵敏度高，准确快速，可用于样品快筛。
2.3 免疫磁性分离技术
免疫磁性分离技术（Immunomagnetic separation，IM）是将磁性微球与免疫化学技术结合起来的一种方法。该技术使食品中的致病菌快速有效的富集，从而提高了检出率，也缩短了检测周期。喻伟等[6]建立了利用免疫磁珠技术富集小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，确定了免疫磁珠技术的灵敏度和最佳浓度，并降低了免疫磁珠在富集过程中的非特异性反应。结果表明免疫磁珠技术具有快速、灵敏度高、准确等特点。
3 分子生物学技术
3.1 环介导等温扩增技术
环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一种新的核酸扩增技术，具有操作简单、灵敏度高、特异性强等特点。徐德顺等[7]将环介导等温扩增技术应用于小肠结肠炎耶尔森氏菌的快速检测。并建立了LAMP檢测方法。结果表明该方法特异性强、灵敏度高，操作简便、检测成本低、
1 h即可完成。杨澜[8]在LAMP法的基础上加入荧光染料，建立了实时荧光LAMP法检测小肠结肠炎耶尔森氏菌和其他非小肠结肠炎耶尔森氏菌。该方法具有灵敏度高、耗时短、操作简单等优点。
3.2 滚环扩增技术
滚环扩增（Rolling circle amplification，RCA）是一种恒温核酸扩增技术。其具有高灵敏度、高特异性等特点，已被用于基因测序、芯片技术、病原菌快速检测等方面。姜英辉等[9]建立和优化了滚环扩增建检测体系，构建可快速检测食品中的小肠结肠炎耶尔森氏菌的RCA检测方法，并进行了特异性和灵敏度试验。结果表明，所建立的小肠结肠炎耶尔森氏菌RCA检测方法，特异性强，可用于小肠结肠炎耶尔森氏菌快速检测方面。
3.3 聚合酶链式反应技术
（1）实时荧光定量PCR技术。实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）是分子生物学的一种，它具有操作简便、快速高效的特点，同时具有很高的敏感性和特异性，已被广泛应用于多个领域。Hristo Najdenski等[10]以小肠结肠炎耶尔森氏菌染色体AIL基因设计的特异产物和TaqMan探针，建立一种能快速检测鲜奶中小肠结肠炎耶尔森氏菌的实时荧光定量PCR方法。结果表明：该方法特异性强、灵敏度高，可以用于定量检测人工和自然污染的小肠结肠炎耶尔森氏菌鲜奶样品，以及人感染鲜奶中小肠结肠炎耶尔森氏菌后的快速诊断。
（2）多重PCR技术。多重PCR（Multiplex PCR）是一种能同时扩增出多条目标基因片段的扩增技术，能用于多种致病菌的同时检测。S Bhaduri等[11]应用多重PCR、PCR-ELISA和荧光定量PCR三种方法对猪粪中小肠结肠炎耶尔森氏菌进行检测，结果表明多重PCR比另外两种方法更灵敏准确。武卫影等[12]建立了能同步简便快速地检测食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌的三重PCR方法，具有较高的灵敏度和准确度。
3.4 生物芯片技术
（1）基因芯片技术。基因芯片（Gene chip）是在一块基片上固定序列和核酸探针的位置，通过荧光强度来获取靶核酸互补序列的探针技术，具有高通量、高灵敏度的特点。金大智[13]建立了小肠結肠炎耶尔森氏菌等15种肠道致病菌基因芯片检测方法和9种重要烈性致病菌基因芯片检测方法，该方法具有快捷、准确、高通量等特点，可以作为食品安全检测的初筛辅助工具，也为食品安全检测、卫生监督等提供了快速、有效的诊断手段。
（2）xMAP液态芯片技术。xMAP液态芯片技术（Flexible Multi-analyte profiling，xMAP）是一种新的生物芯片技术，其具有快速、操作简单、灵敏度高、重复性好和高通量的特点。胡瑞[14]建立了针对小肠结肠炎耶尔森氏菌等四种病原菌快速甄别和多重检测的xMAP液态芯片方法。结果表明，该方法具有多重检测、特异性和灵敏度高等特点，为病原微生物的多重快速检测提供了新方法。
（3）可视芯片技术。可视芯片技术（The thin-film biosensor chips）是一种新型基因芯片。具有快速、准确、高通量等特点，赵金毅[15]针对小肠结肠炎耶尔森氏菌等病原菌建立了一套致病菌可视芯片检测技术。该技术可以一次检测出2个属和9个种的常见致病菌。结果表明了可视芯片技术是一种可以用于致病菌快检的新技术。
4 生物质谱技术
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF-MS）是一种新型生物质谱。Roger Stephan等[16]利用MALDI-TOF-MS对小肠结肠耶尔森氏菌进行快速鉴定和血清型分型，同时他们开发了包括19种小肠结肠炎耶尔森氏菌以及24种非耶氏菌的质谱数据库，结果表明对117株盲样的鉴定都被正确识别。MALDI-TOF-MS可快速鉴别不同血清型的小肠结肠炎耶尔森氏菌菌株，具有很好的稳定性和重复性，可以用于食品检测。
5 结语
近年来，食品安全问题逐渐引起了人们的重视，为了加强对食品安全的监管，提高检验机构的检测能力刻不容缓。目前，小肠结肠炎耶尔森氏菌的检测以常规分离鉴定技术为主，一些免疫学和分子生物学技术（如PCR，ELISA）已经得到了广泛的应用，但这些技术因为种种原因没有被社会认可。未来，免疫学、分子生物学、代谢学、电化学等学科交叉领域将成为开发方便快捷、准确高效的检测技术的重点发展方向。
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作者简介：陈学强（1984—），男，硕士，工程师；专业方向为微生物检验。