摘要：目的：探讨HO－1启动子微卫星多态性与COPD易感性的关系。方法：应用PCR技术结合聚丙烯酰胺凝胶电泳及硝酸银染色，根据年龄组及吸烟史对57例COPD患者和44例非COPD人群血红素加氧酶－1(HO－1)启动子微卫星多态性进行分析。结果：COPD组HO－1基因启动子(GT)n大量重复序列(n＞30)(L型等位基因)的频率(0．2105)显著高于对照组(0.0909)(P＜0.05)而(GT)n小量重复序列(n＜25)(S型等位基因)的频率(0．3158)显著低于对照组(0.4545)(P＜0．05)。不同年龄组以及在吸烟指数＜31PY时，两组人群HO－1启动子微卫星多态性分布未发现显著性差异(P＞0．05)，但当吸烟指数≥31PY时，COPD组L型等位基因频率显著高于对照组(P＜0．05)。结论：①HO－1启动子(GT)n大量重复序列可能与大量吸烟人群的COPD易感性有关，可能在一定程度上参与了COPD的发病机制。②HO－1基因启动子微卫星多态性可作为一种遗传标记用于早期发现对COPD易感的高风险吸烟人群，对于预防COPD的发展具有重要意义。
关键词：HO－1基因；微卫星多态性；COPD；易感性
中图分类号：R816．41 文献标识码：A 文章编号：(2007)01－0097－05
慢性阻塞性肺病(COPD)是一常见的呼吸系统疾病，包括慢性阻塞性支气管炎和慢性阻塞性肺气肿，其气流受限呈慢性进行性。吸烟是COPD发展过程中最危险的因素，然而，仅10－20%的长期吸烟者最终发展成为症状性COPD，表明COPD的发生发展可能存在着遗传易感性。氧化／抗氧化失衡是COPD发病机制之一，如香烟烟雾中过多的氧化剂和自由基直接促进肺组织细胞损害，可能是COPD发病过程的主要启始因子。血红素加氧酶－1(HO－1)是血红素加氧酶(HO)的可诱导性同工酶，研究发现H0－1不仅受底物血红素诱导，许多非血红素物质，如香烟烟雾中的毒性物质(自由基、重金属及氧化剂等)、内毒素及炎症细胞因子等也可诱导其表达，这种诱导作用在防御血红素及非血红素氧化损伤中，在维持细胞内环境稳定方面起重要作用，因此HO-1的不同诱导表达水平可能与一些氧化应激性疾病的发病相关。近年来研究发现HO－1基因启动子5’端区域(GT)n重复序列具有高度多态性，在热应激状态下(GT)n重复序列对HO－1的基因转录可能产生不同的调节作用。由于HO－1基因启动子5’端区域(GT)n不同重复序列影响了氧化应激对HO－1基因表达的诱导，从而影响了HO－1的抗氧化应激作用而可能与COPD的发病相关。据此，我们利用PCR技术分析了COPD的吸烟人群和和非COPD的吸烟人群其HO－1基因启动子(GT)n重复序列等位基因不同的频率分布，以探讨HO－1基因启动子微卫星多态性与COPD发生发展的相关性。
一、材料与方法
1．人群选择
符合中华医学会呼吸病学分会COPD诊治规范标准(草案)的COPD稳定期病人57例。年龄37～86岁，平均年龄58．96±13．44岁。男性49例，女性8例。一秒钟用力呼气容积占预计值百分比(FEV1占预计值%)平均为(46±15)%；一秒率用力呼气容积，用力肺活量(FEV1/FVC)平均为(52±5)%。所有患者无呼吸系变态反应病史，皮肤过敏原实验阴性，且无癌症，胶原血管疾病，先天性心脏病等严重疾患。对照组为非COPD人群44人，男性31例，女性13例。年龄20～80岁，平均年龄41．18±16．05岁。对照组人群均无慢性呼吸系疾病史，肺功能检查各项指标均正常。COPD组无吸烟史者17人，有吸烟史者40人。对照组无吸烟史者18人，有吸烟史者26人。吸烟指数以PY计算[1PY=1盒香烟(20支)，天×1年]。应用一次性定量真空采血管(武汉致远医疗科技有限公司产品)分别采集病人及对照组外周静脉血5ml，置-800C保存备用。
2．试剂
Taq酶、PCR缓冲液、dNTP、丙烯酰胺及亚甲双丙烯酰胺均为上海Sangon生物工程公司产品。DNA分子量标记pBR322 DNA/HaeⅢ为华美生物工程公司产品。
3．方法
(1)模板DNA的制备常规蛋白酶K消化，酚／氯仿外周血白细胞中提取基因组DNA。
(2)HO－1基因启动子5’端poly(GT)n区域扩增。
引物设计参照文献(由上海Sangon生物工程公司合成)：上游：5’－AGAGCCTGCAGCTYCTCAGA－3’；下游：5’－ACAAAGTCTGGCCATAGGAC－3’，扩增片段大小为67bp+(GT)n。
PCR反应体积为100gl，含10×PCR缓冲液10μl(50mmol/L KCl，10mmol/L Tirs-HCl，15mmol/LMgCl2)，dNTP 200μmol/L，每条引物30pmol，50ngDNA，2单位的Taq DNA聚合酶。PCR反应程序为94℃初始变性5分钟后进行29次循环：95℃30秒，55℃30秒，72℃1．5分钟，随后72℃延伸5分钟。
(3)电泳和银染
取PCR产物10μl上样于10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳上。电压60V，时间5-6小时。电泳后，将凝胶置于含10%乙醇与0．5%冰乙酸的固定液，固定10分钟，然后用双蒸水洗涤两次，每次5分钟；将其放入银染液(0．15%AgN03)染色10分钟，然后用用双蒸水洗涤三次，每次20秒；放入0．5%NaOH及15%甲醛的显色液中显影至可见清晰条带为止，约10－20分钟；再将胶放入终止液(10%冰乙酸)以终止反应，持续10分钟；最后将胶置入脱水液(20%乙醇)脱水10分钟，吸取水分，室温下晾干，扫描后拍照。
(4)标准曲线的拟合及DNA片段长度的估计
测量已知DNA分子量标记的迁移率作为自变量(X)，其长度(bp)为因变量拟合标准曲线。测量加样孔前沿至DNA条带间的距离，代入标准曲线，求得待测DNA片段长度。根据文献计算(GT)n重复拷贝数n=(扩增的DNA片段长度－67)/2。
(5)杂合度(HET)及多态信息容量(polymorphisminformation content，PIC)计算采用文献计算公式分别为：
式中n为该位点的等位基因数；Pi为第i个等位基因的频率。
(6)统计学处理
采用x2检验进行Hardy-Weinberg平衡(HWE)检验及将每一基因型吻合度度X2值相加，计算公式：x2=∑(期望值一观察值)2／期望值。采用Woof公式
计算相对风险率(relative risk，RR)。两组人群HO－1微卫星多态位点基因频率及基因型频率的构成比用x2检验进行比较。
二、结果
1．标准曲线的拟合
应用SPSS10.0软件非线型回归模型显示最适模型为三次曲线模型：Y=bo+b1x+b2+b3X3(Y为分子量；x为迁移率)。根据每次电泳结果共拟合12个三次曲线方程，F值为604．51－911．61，相关系数R2值为0．986～0．998，P值均＜0．001。
2．HO－1基因启动子(GT)n重复序列的多态分布及其与COPD的关系
(1)两组人群HO－1基因启动子(GT)n重复序列的多态分布特征及比较
PCR产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图见图1。HO－1基因启动子(GT)重复序列数目(n)呈高度多态性，其数值范围为16～38，PIC为0．889。频率(0．2525)最高的是n=27，其次为22(0．1238)和30(0．0693)。对照组PIC及HET分别为0．887、0．892，COPD组PIC及HET分别为0．878、0．885(见表1)。参考文献根据n值的不同分为三组人群，n＜25为小量重复序列(S等位基因)；25－29为中量重复序列(M等位基因)；≥30为大量重复序列(L等位基因)。COPD组与对照组HO－1基因微卫星多态位点等位基因及基因型分布(见表1与表2)。两组基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(P＞0．75，P＞0．5)，提示所计算的两组基因型频率与预期基因型频率基本一致，具有群体代表性。COPD组中含有L等位基因的基因型(L/L、L/M、L/S，I组)频率显著高于对照组，而非L等位基因的基因型(Ⅱ组)频率显著低于对照组(P＜0．01)。两组间各等位基因频率分布有显著性差异(X2=6．93，P＜0．05)，S型与M型基因频率无显著性差异(X2=1．7133，P＞0．1)，COPD组L型基因频率显著高于对照组(X2=6．33，P＜0．01)而其S型频率显著低于对照组(X2=4．074，P＜0．05)(见表1)。L型等位基因对(s+M)等位基因的RR为2．67(95%CI 1．13－6．27)(X2=5．0555，p＜0．025)，而s对(L+M)等位基因的RR为0．55(95%CI 0．31－0．99)(P＜0．05)(见表3)
注：1．检验自由度(df)为：df=基因型数目—等位基因数。
2．HWEx2检验中 x2=∑(期望值－观察值)2／期望值，其中A/A基因型期望值=(A等位基因型频率)2×n，A/G基因型期望值=(2×A等位基因型频率×G等位基因型频率)×n，G/G基因型期望值=(G等位基因型频率)2×n。
S：(L+M)
(2)两组人群中不同年龄组、不同吸烟史与HO－1(GT)n重复序列多态分布的关系
本研究发现在不同年龄组中COPD组L型等位基因的频率似乎高于对照组，但无统计学意义(P值均＞0．05)。在吸烟指数<31PY时COPD组L型等位基因的频率均高于对照组但未发现统计学意义(P值均＞0．05)。当吸烟指数(PY)≥31PY时，COPD组L型等位基因的频率显著高于对照组(P＜0．05)，L型等位基因对其他基因型的RR为13．8(95%CI4．66～40．85)(见表4)。
M：分子量标记1：HO－1 S/S基因型；2：HO－1M/S基因型；3：HO－1M／M基因型；4：HO－1 L/M基因型；5：HO－1 M/M基因型；6：HO－1M/M基因型；7：HO－1M/S基因型。
三、讨论
COPD发病机制的主要病理过程是肺部炎症，氧化／抗氧化失衡及蛋白酶／抗蛋白酶失衡。肺部氧化负荷增加的原因主要为香烟中的氧化剂和自由基。HO－1防御氧化应激的机制可能在于以下几个方面。HO－1在氧化分解血红素的反应中所释放的铁有助于诱导铁蛋白的合成，活性氧(ROS)(超氧化物和H2、O2等)的毒性作用取决于铁的出现。细胞内游离铁池与超氧化物和H2、O2反应产生毒性的羟自由基(Fenton反应)，由于HO－1催化血红素释放的游离铁能诱导铁蛋白合成，因此作为一种铁储存库的形式限制铁参与Fenton反应。胆红素作为血红素分解的代谢产物其本身就是一种强抗氧化剂。体外研究发现胆红素能有效的清除过氧化氢自由基。Stocker等进一步研究发现人正常血浆浓度的胆红素可防止白蛋白氧化。HO－1所产生的CO与核转录因子－kB(NF－KB)共同作用能防御肿瘤坏死因子－a(TNF－a)介导的血管内皮细胞的凋亡。上述结果提示HO－1的不同诱导表达水平可能与COPD的发生发展相关。HO－1基因5’端区域(GT)n重复序列位于热休克元件和顺式调节元件之间，其中一些特殊形式的等位基因可能影响HO－1基因的转录，可以推测HO－1基因5’端区域(GT)n重复序列的长度可能与COPD的发病机制相关。
我们的结果显示，两组人群中HO－1启动子不同(GT)n重复序列的6种等位基因的频率符合ardy-Weinberg平衡遗传定律，表明具有群体代表性。对照组PIC及HET分别为0．887、0．892，COPD组PIC及HET分别为0．878、0．885，提示：HO－1基因启动子微卫星多态性具有丰富的多态信息量，可作为遗传多态标记研究该基因与COPD易感性的关系。在两组人群中发现，COPD组L型基因频率显著高于对照组而其S型频率显著低于对照组，L型等位基因对(S+M)等位基因的RR为2．67，而S对(L+M)等位基因的RR为0．55，提示L型等位基因的个体与非L型的个体相比，患COPD的风险性增加了1．67倍，而S组的个体与非S型的个体相比较，患COPD的风险性降低了0．45倍。根据不同年龄、不同吸烟史进行分析发现，当吸烟指数≥31PY时，COPD患者HO－1基因启动子(GT)n大量重复序列的频率显著高于对照组，提示大量长期吸烟者且具有L型等位基因的个体与其他个体比较对COPD的易感性增加了。我们的结果与Yamada等在日本吸烟人群中的肺气肿患者中研究HO－1基因启动子微卫星多态性与肺气肿的易感性的结果相似，他们的结果表明HO－1基因启动(GT)n大量重复序列可能降低吸烟过程中产生的ROS对HO－1基因的诱导因而导致肺气肿的发生。
总之，HO－1基因启动子微卫星多态性可作为一种遗传标记用于早期发现对COPD易感的高风险吸烟人群，对于预防COPD的发展具有重要意义。但HO－1基因启动子微卫星多态性与COPD的易感性的研究还处在初级阶段，该多态性与COPD的易感性在不同种族可能有所差异。有关HO－1基因启动子微卫星多态性与COPD的易感性的在不同种族的大样本研究及其机制需要进一步探讨。此外，COPD的发生发展与多种基因的易感性相关，当多种基因共同发挥作用时，单个基因的影响相对减弱，显然单一基因型不能解释COPD发病中全部的基因调控机制及其遗传易感性。今后的工作将集中在多个基因的多态性与COPD易感性的关系上，以寻找出预防COPD发生发展的多种基因标志。
收稿日期：2006－09－25
作者简介：马志明(1961－ )，男，河南柘城人，医学博士，广州市胸科医院呼吸内科副主任医师。通讯作者：韩泽民(1966－ )，男，河南柘城人，医学博士，副教授，中国人民武装警察部队医学院附属医院副主任医师，研究方向为颅颔面部整形与种植修复。
基金项目：“十五”国家科技攻关计划项目[编号2001BA703803(B)；卫生部部属临床学科重点项目(学科代码3202060)
[责任编辑 沈 勇]
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