受褐飞虱诱导的水稻酵母双杂交文库的构建

材料和方法

１．１实验材料

建库所用水稻品种为９３１１；所用褐飞虱饲养在武汉大学植物遗传研究所的水稻品种台中本地一号（ＴＮ１）上。构建酵母文库的试剂盒购自Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司，ＲＮＡ提取试剂盒购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ公司。

１．２方法

１．２．１水稻处理将水稻品种９３１１播种于直径９ ｃｍ的塑料杯中。４叶期时分别于０、３、６、１２、２４、４８、７２、９６ ｈ按每棵苗８头间隔接入褐飞虱，同一时间终止反应。

１．２．２ＲＮＡ的提取采用Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司的ＲＮＡ提取试剂盒提取水稻叶鞘的ＲＮＡ。提取后的ＲＮＡ进行电泳，检测其质量，并调整ＲＮＡ的量至所有样品相同。

１．２．３ｃＤＮＡ的合成参照Ｃｌｏｎｔｅｃｈ试剂盒的说明，先合成ｃＤＮＡ第一链，再通过ＰＣＲ扩增双链ｃＤＮＡ，并纯化以去除小片段ｃＤＮＡ。

１．２．４酵母感受态细胞的制备按照Ｃｌｏｎｔｅｃｈ试剂盒的说明制备Ｙ１８７感受态细胞，制备好的感受态细胞要立即使用。

１．２．５酵母文库的转化按照Ｃｌｏｎｔｅｃｈ试剂盒的要求，将扩增的双链ｃＤＮＡ、线性化的ｐＧＡＤＴ７－Ｒｅｃ转入酵母感受态细胞Ｙ１８７。在直径１５０ ｍｍ的ＳＤ／－Ｌｅｕ培养皿上涂抹１５０ μＬ菌液（共１００个培养皿）。在直径９０ ｍｍ的ＳＤ／－Ｌｅｕ培养皿上分别涂抹１∶１０，１∶１００和１∶１ ０００的稀释菌液，以检测转化的效率。培养皿在３０ ℃条件下倒置培养３ ｄ至菌落出现。

１．２．６文库的收集和滴度测定根据按比例稀释的平板上的克隆数，计算文库的独立转化的克隆：初始文库独立克隆子数目（库容量）＝每块平板的平均克隆子数目×稀释倍数×悬浮体积。然后用含有３０％甘油的ＬＢ液体培养基清洗培养基上生长的菌落，全部收集于无菌三角瓶中，共３００ ｍＬ。充分混匀后，用血球计数板进行滴度测定。符合滴度要求，再按每１ ｍＬ分装至１．５ ｍＬ的ＥＰ管，保存在－８０ ℃。

１．２．７ｃＤＮＡ插入片段大小的檢测随机挑取平板上生长的单菌落，以ｐＧＡＤＴ７载体通用引物Ｔ７和ＡＤ对其进行ＰＣＲ扩增，电泳检测ｃＤＮＡ插入片段的大小。

２结果与分析

２．１ＲＮＡ的质量及浓度

用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测提取的总ＲＮＡ纯度（图１）。结果显示：提取的ＲＮＡ含量高，纯度好，未发生降解，满足建库需要；同时，调整ＲＮＡ样品的上样量，使受褐飞虱取食８个时间段的水稻ＲＮＡ样品量相同。相同质量的ＲＮＡ混合后，反转录得到单链ｃＤＮＡ。

２．２ｃＤＮＡ合成和纯化结果

ｍＲＮＡ反转录合成第一链后，ＬＤ－ＰＣＲ扩增获得双链ｃＤＮＡ。取５ μＬ扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，确定扩增片段的大小符合要求。用试剂盒提供的纯化柱进行纯化去掉２００ ｂｐ以下的小片段。电泳结果显示纯化后的双链ｃＤＮＡ的大小主要在３００～

３ ０００ ｂｐ之间（图２）。

２．３文库的容量与滴度

根据公式计算得知９３１１的初始文库独立克隆子数目为２．２２×１０６ CFU；用液体培养基收集后，血球计数板检测文库的滴度为５．４×１０７ CFU／ｍＬ。２０多倍的文库滴度既保证了ｃＤＮＡ文库的完整性和覆盖度，也减少了筛库的工作量。

２．４酵母文库插入片段大小

随机挑选２４个文库转化子，通过ＰＣＲ反应检测文库插入片段大小。从图３中可以看出：所构建的９３１１酵母文库中，插入片段大小不等，具有良好的多样性；插入片段大小主要分布在４００～１ ５００ ｂｐ之间，密集分布在７００～１ ０００ ｂｐ之间，文库插入片段平均大小约为８８０ ｂｐ。

３讨论

用于构建水稻酵母双杂交文库的水稻品种是９３１１，其并不具有对褐飞虱的抗性。但是有研究表明通过分子标记辅助选择将抗褐飞虱基因导入９３１１后，育成的材料具有稳定的抗性［１０，１１］。考虑到９３１１具有优良的农艺性状，已测序完成，有可用的基因组序列，且多个抗褐飞虱基因均能在９３１１中发挥作用。所以选择用受褐飞虱取食诱导的９３１１来构建酵母双杂交文库，以用于筛选与抗性相关基因互作的蛋白。

对文库质量的评价主要体现在两个方面。一方面为文库的代表性，指文库中包含的重组ｃＤＮＡ分子反映来源组织中表达信息（即ｍＲＮＡ种类）的完整性，其好坏可用文库的库容量来表示，指构建的初始ｃＤＮＡ文库中所包含的独立的重组子克隆数。库容量取决于来源组织中所表达的ｍＲＮＡ种类和每种ｍＲＮＡ的拷贝数。因此，ＲＮＡ的提取是ｃＤＮＡ合成和文库构建过程中最为关键的一步。本研究严格按照试剂盒说明抽提并纯化ｍＲＮＡ，通过质量评价确定所提取的ＲＮＡ产量高、纯度好，未发生降解，且调整浓度至所有样品量一致。测定酵母文库的库容量大于１×１０６ CFU，保证了文库的完整性和覆盖度。文库质量评价的另一个方面是重组ｃＤＮＡ片段的序列完整性。本研究在合成ｃＤＮＡ的过程中，尽可能保证ｃＤＮＡ序列的完整性。对构建的文库ｃＤＮＡ插入片段ＰＣＲ结果分析表明，插入片段大小主要分布在４００～１ ５００ ｂｐ之间，密集分布在７００～

１ ０００ ｂｐ之间，文库插入片段平均大小约为８８０ ｂｐ。本研究所构建的水稻品种酵母双杂交文库经分析评价确定其质量达到了酵母双杂交研究的标准，可以用来进行大规模的互作蛋白筛选实验。

在植物与病原菌相互作用的研究中，人们通过酵母双杂交系统，在不同的植物中筛选到了与抗病蛋白相互作用的蛋白分子。Ｍａｃｋｅｙ等［１２］通过筛选拟南芥的酵母双杂交文库，发现拟南芥的抗病蛋白ＲＰＭ１和ＲＰＳ２通过ＲＩＮ４蛋白与三种不同的病原菌Ａｖｒ蛋白相互作用，使拟南芥产生抗病反应。Ｙｕａｎ等［１３］在水稻中筛选出了与抗白叶枯基因Ｘａ１３互作的蛋白ＣＯＰＴ１和ＣＯＰＴ５，这两个蛋白调节水稻体内铜离子的含量，从而使水稻产生抗病反应。但是，在水稻抗虫研究中，由于并没有克隆出水稻的抗虫基因，所以很少有通过酵母双杂交系统研究水稻与昆虫相互作用的报道。目前，水稻抗褐飞虱基因Ｂｐｈ１４已经被成功克隆出来［５］，因此构建受褐飞虱取食的水稻酵母双杂交文库，能为筛选与Ｂｐｈ１４互作的蛋白分子，从而研究水稻抗褐飞虱的分子机理奠定基础，并对研究植物与刺吸式口器昆虫的相互作用具有参考意义。

参考文献：

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