摘要：本研究建立了基于量子点的鸡新城疫病毒（NDV） sFLISA检测方法。该方法以抗NDV多克隆抗体为捕捉抗体、以生物素标记抗NDV单克隆抗体为检测抗体、以量子点标记的链霉亲和素为荧光探针。该方法与其它有关禽类病毒（产蛋下降综合征病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、禽白血病病毒）无交叉反应，比血凝试验灵敏，为临床早期快速检测NDV提供了行之有效的方法。
关键词：鸡新城疫病毒（NDV）；量子点；双抗夹心荧光免疫分析（sFLISA）
中图分类号：S858.31文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）05-0118-04
新城疫是由新城疫病毒（Newcastal disease virus，NDV）引起的急性、高度接触性传染病，常呈败血症，主要特征是呼吸困难、下痢、神经机能紊乱、黏膜和浆膜出血，严重危及禽类养殖业的发展，现流行于世界各国[1～3]。新城疫被国际兽疫局（OIE）定为A类传染病，中国将其列为一类动物疫病[4]。
新城疫病毒的检测主要应用免疫方法（包括免疫传感技术、蛋白质芯片技术、胶体金免疫层析技术、免疫组化技术、免疫荧光技术等）和分子生物学技术（包括RT-PCR技术、基因芯片、液相芯片技术等）[5]。量子点（Quantum dots，QDs）是近年发展起来的一种新型荧光纳米材料，与传统有机荧光染料相比，具有荧光稳定性高、吸收光谱宽、发射光谱窄而对称、衰减寿命长、生物相容性好等特点，已经成为病原检测的新工具[6～9]。
本研究以抗NDV多克隆抗体为捕捉抗体，以生物素标记抗NDV单克隆抗体为检测抗体，以量子点标记的链霉亲和素为荧光探针，建立了NDV sFLISA检测方法，为养殖业早期发现NDV感染提供了有力的工具。
1材料与方法
1.1试验材料
灭活新城疫病毒（NDV，HA效价为256）和阳性尿囊液病毒由本试验室保存。鸡产蛋下降综合征病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、禽白血病病毒抗原、鸡新城疫病毒（La Sota株）国家参考品、抗鸡新城疫病毒阳性血清和鸡新城疫试验用阴性血清购自国家兽医微生物菌种保藏中心。
1.2主要试剂和抗体
兔抗NDV多克隆抗体（GLOBAL BIOTECH，1 μg/μL）；鼠抗NDV单克隆抗体（GLOBAL BIOTECH，1 μg/μL）；量子点标记的链霉亲和素-605（QS605，武汉珈源量子点技术开发有限公司）；包被液：0.05 mol/L碳酸盐缓冲液（pH 9.6）；洗涤液：0.5% Tween-20的磷酸盐缓冲液（PBS）；封闭液：1× BSA-PBS。
1.3主要仪器和器材
多功能荧光酶标仪（SpectraMax M5）；6930型冷冻离心机（日本KUBOTA公司）；5415R 微量冷冻离心机（德国Eppendorf 公司）；MS3涡流旋转振荡仪（德国IKA公司）；黑色底透的荧光酶标板（Thermofisher NUNC）；Eppendorf移液枪（0～200 μL、0～1000 μL，德国Eppendorf 公司）；冰箱[冷藏温度（4±1）℃，中国海尔]；恒温培养箱[（37±1）℃、（42±1）℃，日本SANYO]。
1.4尿囊液病毒的制备
4℃反复冻融尿囊液3次，然后3 000、5 000、8 000 r/min 各离心30 min，上清经100 000×g离心2 h，用少量 TEN 缓冲液将病毒沉淀悬浮，再用20%～60%的蔗糖溶液经密度梯度离心纯化，经100 000×g 离心8 h，收集40%～60%梯度层内的病毒带，用pH 7.4、0.01 mol/L PBS 透析48 h，分装，于-20℃冻存备用。
1.5 sFLISA标准操作程序
sFLISA在NUNC酶标板反应微孔中完成，具体实验方法如图1所示。微孔板先用100 μL含有1.25 μg/mL的抗NDV多克隆抗体在4 ℃包被过夜（包被液：0.05 mol/L、pH9.6的碳酸盐缓冲液）；洗涤液洗涤3次，200 μL/孔，每次3 min；用1×BSA-PBS封闭，300 μL/孔，37℃ 封闭2 h；洗涤液洗板3次后，加入待测样品，100 μL/孔，37℃孵育1 h；洗板后加入1∶200稀释的生物素标记NDV单克隆抗体，100 μL/孔，37℃孵育1 h；洗板后加入量子点标记的链霉亲和素荧光探针，37℃孵育1 h，洗板后晾干。阴性对照孔加阴性血清，空白对照孔加入100 μL PBS，通过荧光分光光度计测定其相对荧光强度。
1.6sFLISA工作条件的优化
1.6.1多抗包被浓度、生物素标记单克隆抗体稀释度的确定抗NDV多克隆抗体以10、5、2.5、1.25 μg/mL和0.625 μg/mL等5个稀释浓度各100 μL竖排包被聚苯乙烯板，4℃过夜；洗涤封闭后加入标准抗原NDV，100 μL/孔，固定标准抗原NDV浓度；洗涤拍干，生物素标记抗NDV单克隆抗体以1∶200、1∶400、1∶800共3个稀释浓度各100 μL反应，37℃作用1 h；洗涤拍干，加入1∶100稀释的量子点标记的链霉亲和素，37℃作用1 h，洗涤拍干后在多功能酶标仪上用390 nm的激发波长、605 nm的发射波长读取相对荧光强度（RFU）值。根据P/N比值，以确定包被抗体和生物素标记抗体的最佳浓度。
1.6.2量子点标记的链霉亲和素稀释倍数的优化以NDV包被酶标板，生物素标记抗体按1∶200稀释作为检测抗体，量子点标记的链霉亲和素分别按照1∶50、1∶100、1∶200稀释，100 μL/孔加入，37 ℃作用1 h，洗涤拍干后在多功能酶标仪上用390 nm的激发波长、605 nm的发射波长读取相对荧光强度（RFU）值。根据P/N比值，以确定量子点标记的链霉亲和素稀释倍数。
1.7阴阳性判定标准的确定
采用建立的sFLISA方法进行12次阴性对照检测，计算相对荧光单位RFU的平均值（X）和标准差（SD），阳性临界值=阴性样品的X+3SD。检测时，当样品RFU>阳性临界值，判断为阳性。
1.8sFLISA敏感度检测
确定单抗和多抗的最佳工作浓度，将纯化的尿囊液病毒在1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280等8个稀释度进行测定，同时进行原倍毒液试验，设阴性和空白对照。
1.9sFLISA特异性试验
用建立的检测方法对NDV、鸡产蛋下降综合征病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、禽白血病病毒抗原、鸡新城疫病毒（La Sota株）国家参考品进行检测，确定所建立检测方法的特异性。
1.10重复性试验
在同一个酶标板内检测NDV、NDV国家标准品和尿囊液制备的NDV，每样重复3次；选取3块不同酶标板，每个板重复3孔，按1.5的步骤进行sFLISA，分别计算样品的板内和板间变异系数（CV）。
1.11阻断试验
将阳性NDV用灭菌生理盐水按1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320稀释后，50 μL分别加入等量的标准阳性血清（1∶10稀释），37℃作用1 h，10 000 r/min离心，取上清进行检测，以NDV为阳性对照。
2结果与分析
2.1包被多克隆抗体与生物素标记抗体稀释度的确定
包被抗体分别以10、5、2.5、1.25 μg/mL和0.625 μg/mL进行包被，生物素标记抗体分别进行1∶200、1∶400、1∶800的稀释，量子点标记的链霉亲和素以1∶100的稀释度进行偶联。结果表明，包被抗体单抗为1.25 μg/mL，生物素标记的检测抗体1∶200时，其P/N值最大，为56.028。因此，选择1.25 μg/mL作为包被抗体的浓度，1∶200 作为生物素标记抗体的最佳稀释度（见表1）。
2.2量子点标记的链霉亲和素稀释倍数优化
以上述优化的条件，即包被抗体浓度为1.25 μg/mL，生物素标记的检测抗体稀释倍数为1∶200，对量子点标记的链霉亲和素稀释倍数进行优化。结果（表2）表明，在1∶100时，P/N值为61.453，最大，故选择此稀释倍数为最优稀释倍数。
2.3 sFLISA阴阳性界限的确定
在上述优化的反应参数条件下，进行12次阴性血清sFLISA试验，得到阴性试验平均值为0.361，标准差为0.037，X+3SD =0.472，从而确定RFU 值在0.472及以上为阳性，RFU值在0.361～0.471之间为疑似，RFU值在0.361以下为阴性（表3）。
2.4 敏感性分析
将制备好的尿囊液NDV以1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280等8个稀释度稀释，按照优化sFLSA的条件检测结果表明，随着病毒含量的降低，其RFU 值呈下降趋势，但当病毒1∶640 稀释时，结果仍为阳性（RFU值为0.725），表明该方法灵敏度较好。
2.5 特异性试验
在已优化的sFLISA反应条件的基础上，对鸡产蛋下降综合征病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、禽白血病病毒抗原、鸡新城疫病毒（La Sota株）国家参考品进行了检测，结果只有鸡新城疫病毒（La Sota株）国家参考品为阳性，其它病毒均为阴性，表明本方法具有较好的特异性（表5）。
2.6重复性试验
在同一酶标板内，对NDV、NDV国家标准品和尿囊液制备的病毒进行板内重复性试验，每份样品重复3次。重复性分析结果显示：板内变异系数为1.5%～4.1%，板间变异系数为1.5%～3.0%（表6），变异程度很小，均小于10%，表明该方法具有较好的重复性。
2.7阻断试验
结果表明（表7），经稀释的NDV作为被检材料，标准阳性血清能特异性地阻断NDV与包被抗体的结合，病毒1∶40稀释后检测结果呈阴性。
量子点作为一种新型的荧光探针，被越来越多地应用到病原生物检测中[8]，但应用于动物病毒检测的研究较少。本研究应用量子点标记的链霉亲和素作为荧光探针、生物素标记单克隆抗体作为检测抗体，通过生物素-亲和素之间的特异性互作，建立了一种基于量子点荧光探针的NDV sFLISA检测方法。通过对已知阳性样品的比较测定，阳性样品稀释至640倍还能检出；与其它有关禽类病毒无交叉反应（产蛋下降综合征病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、禽白血病病毒抗原），说明此检测方法对NDV特异性较强，灵敏度高。该方法的建立为NDV的监测和诊断提供了新方法，在进出口检疫上也将发挥良好的作用。
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