材料与方法
1.1 病料 病料来源于安徽省农业科学院畜牧兽医研究所兽医临床诊断中心送检的鹅肝脏。
1.2 培养基与主要试剂 普通肉汤培养基、鲜血培养基由实验室自配；琼脂糖、Taq Master Mix、DNA Marker 2000，均购自上海生工生物工程技术有限公司。
1.3 细菌的分离与纯化 取疑似巴氏杆菌鹅的肝脏接种于普通肉汤培养基进行增菌培养，然后挑取增菌液置于鲜血培养基上，置于37 ℃恒温培养箱内培养24 h。挑取其中特征性可疑的菌落进行二次培养，反复纯化2次，得到其纯培养置于4 ℃冰箱内保存备用。
1.4 染色镜检 从鲜血培养基上挑取1株纯化后的疑似菌落进行涂片，进行瑞氏染色镜检，并观察其染色特性和形态。
1.5 引物的合成 根据GenBank已发布的巴氏杆菌的16S RNA和OmpA基因设计2对引物（表1），引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成。利用设计的2对引物，对菌株进行PCR检测。
1.6 PCR检测鹅致病性巴氏杆菌16S RNA基因 PCR反应体系如下：菌液模板1 μL，Taq Master Mix 10 μL，上、下引物各1 μL，无菌ddH2O补足20 μL。PCR反应程序为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；最后72 ℃延伸8 min。利用1.3%琼脂糖凝胶电泳进行观察，拍照并记录电泳结果。
1.7 PCR检测鹅致病性巴氏杆菌OmpA基因 PCR反应体系如下：DNA模板1 μL，Taq Master Mix 10 μL，上、下引物各2 μL，无菌ddH2O补足20 μL。PCR反应程序为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循环；最后72 ℃延伸10 min。利用1.3%琼脂糖凝胶电泳进行观察，拍照并记录电泳结果。
1.8 PCR产物的纯化、克隆与序列分析 对16S RNA基因和OmpA基因的PCR产物按照DNA回收试剂盒说明书进行回收目的片段。然后，进行T载体连接，10 μL体系包括PMD18-T 0.5 μL、目的基因4.5 μL，solution I 5 μL，16 ℃水浴30 min。最后，转化至DH5α大肠杆菌感受态细胞内，并涂布在含抗生素氨苄的培养基上置于37 ℃恒温培养箱内培养过夜，取经PCR检测出目的条带的菌落进行测序。测序工作由合肥安博森生物科技有限公司完成，对测序基因序列进行同源性分析。
2 结果与分析
2.1 病理剖检 病鹅剖检呈典型败血性变化，肝脏表面出现大量针尖大的白色坏死点（图1）。
2.2 细菌分离与鉴定 接种于鲜血培养基上，呈现出半透明的灰白色、露珠样、微微隆起且表面光滑、边缘整齐的小菌落[2]。从鲜血培养基上挑取其中单一的典型菌落进行瑞士染色，通过镜检可见两极着色的短杆菌。
2.3 对巴氏杆菌进行16S RNA基因和OmpA基因检测 16S RNA基因和OmpA基因的PCR扩增产物大小分别为862和201 bp，与目的片段大小一致，检测结果如图2所示。
2.4 同源性分析 对16S RNA基因序列进行Blast对比，其与多杀性巴氏杆菌CP019081.1、CP007205.1、CP004392.1的同源性最高，达到99%。对OmpA基因序列进行Blast對比，其与多杀性巴氏杆菌CP020403.1、CP019081.1、KX161895.1的同源性最高，达到99%。因此，可确定分离菌为多杀性巴氏杆菌。
2.5 生化试验结果 对病料中分离出的细菌按照常规方法进行了生化鉴定，结果见表2。
3 讨论
此鉴定方法应用于葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、禽流感等时均不能扩增出目的片段.却可从禽多杀性巴氏杆菌扩增出862和201 bp大小的特异性片段[4-6]，表明引物只对禽多杀性巴氏杆菌有特异性，敏感性强，基本不会出现杂菌干扰。生化鉴定是进行细菌鉴定分型的标准方法，但该方法所需要的时间过长，操作也相对繁琐，且所需要的仪器较多，耗费大量的人力和物力。应用PCR检测技术不仅可对纯培养物进行检测，又可直接从病料的初次培养物中进行检测，不必进行纯化培养，还可从病料组织中直接提取DNA，操作简单，大大缩短检测所需时间，能达到准确、快速诊断的目的，对于及早采取有效的防治措施具有重要的实践意义[7-9]。
参考文献
[1] 李浩，刘阳，李长安.多杀性巴氏杆菌病研究进展[J].畜牧兽医杂志，2011，30（2）：31-33.
[2] 高明燕，徐步，赵宝华，等.多杀性巴氏杆菌检测、鉴定和分型研究进展[J].动物医学进展，2010，31（1）：67-72.
[3] 管宇，沈志强，刘吉山，等.应用16S rRNA基因测序法鉴定禽多杀性巴氏杆菌的研究[J].中国预防兽医学报，2003，25（5）：349-352.
[4] 亓英芳，刘家森，张在平，等.禽多杀性巴氏杆菌PCR诊断方法的建立[J].黑龙江畜牧兽医，2008（7）：68-69.
[5] 贺荚，储岳峰，赵萍，等.多杀性巴氏杆菌的分离和PCR鉴定[J].江西农业大学学报，2008，30（4）：702-705.
[6] 施少华，程龙飞，傅光华，等.检测禽多杀性巴氏杆菌PCR方法的建立[J].福建农业学报，2009，24（3）：201-204.
[7] 施少华，陈红梅，程龙飞，等.检测禽多杀性巴氏杆菌环介导等温扩增（LAMP）方法的建立[J].福建农林大学学报（自然科学版），2010，39（4）：388-391.
[8]曾静雯，刘慧芳，沈琴芳，等.多杀性巴氏杆菌鉴定与特性研究的分子生物学方法[J].中国兽药杂志，2006，40（4）：41-44.
[9] KUMAR P，SINGH V P，AGRAWAL R K，et al.Identification of Pasteurella multocida isolates of ruminant origin using polymerasechain reaction and their antibiogram study[J].Trop Anim Health Prod，2009，41（4）：573-578.