[摘要] 目的 研究促红细胞生成素类似结构[促红细胞生成素B螺旋结构表面缩氨酸（pHBP）]对大鼠心肌缺血再灌注（I/R）损伤的影响及蛋白激酶丝氨酸/苏氨酸激酶（p44/p42 MAPK）表达。 方法 80只大鼠随机分为四组：假手术组（n=20）、I/R组（n=20）、I/R+促红细胞生成素（rhEPO）组（n=20）和I/R+pHBP组（n=20）。采用垫扎球囊结扎冠状动脉方法制作心肌缺血再灌注动物模型，I/R+ rhEPO组和I/R+pHBP组分别于缺血再灌注后5 min经尾静脉注射rhEPO（3000 U/kg）、pHBP（1 μg/kg），I/R组及假手术组给予等体积生理盐水，检测血清乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）含量，采用TTC染色确定梗死面积。术后3、24 h，Western blot法检测细胞外信号调节的p44/p42 MAPK表达。 结果 与I/R组心肌梗死面积[（18.45±1.24）%]比较，I/R+rhEPO组[（12.32±1.27）%]、I/R+pHBP组[（11.64±2.32）%]心肌梗死面积下降，差异有统计学意义（P < 0.05）；与I/R组血清LDH[（3012.24±175.21）U/L]及CK-MB[（216.02±15.24）U/L]比较，I/R+rhEPO组和I/R+pHBP组的血清LDH及CK-MB[（2433.24±116.32）、（2511.12±98.72）、（128.16± 17.52）、（121.31±21.43）U/L]均下降，差异有统计学意义（P < 0.05）；制模3 h，与I/R组比较，I/R+pHBP组p44/42 MAPK蛋白表达明显增高，差异有统计学意义（P < 0.05）；制模24 h，与I/R组比较，I/R+rhEPO组p44/42 MAPK蛋白表达明显增加，差异有统计学意义（P > 0.05）。 结论 pHBP在大鼠心肌缺血损伤中具有心脏保护作用，其保护机制可能与其抑制心肌细胞凋亡有关。
[关键词] 促红细胞生成素类似结构；缺血再灌注；丝氨酸/苏氨酸激酶
[中图分类号] R332 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）09（c）-0017-04
Cardioprotective effect of small nonerythropoietic helix B surface peptide on heart ischemia/reperfusion injury rats and expression effect of p44/42 MAPK
WANG Yuanyuan1 CAO Jian2▲ DENG Li1 CHEN Qin1 OUYANG Xianguo1
1.Department of Cardiology， the Third Hospital of Nanchang， Jiangxi Province， Nanchang 330009， China； 2.Department of Anesthesiology， the Second Affiliated Hospital of Nanchang University， Jiangxi Province， Nanchang 330006， China
[Abstract] Objective To investigate the protective effects of small nonerythropoietic helix B surface peptide （pHBP） based upon erythropoietin structure on heart ischemic myocardial damage （I/R） of rats， and the expression effect of p44/p42 MAPK. Methods 40 rats were randomly divided into 4 groups： sham-operated group （n=10）， I/R group （n=10）， I/R+rhEPO group （n=10） and I/R+pHBP group （n=10）. Experimental model was established by ligating the left anterior descending coronary artery， I/R+rhEPO group and I/R+pHBP group were treated with rhEPO （3000 U/kg）， pHBP （1 μg/kg） respectively after ischemia reperfusion 5 min， and the sham operation group and I/R group were given saline instead. Serum LDH，CK-MB were assessed， myocardial infarct areas were measured by TCC dyeing. After 3， 24 h of treatment， the expression of p44/p42 MAPK was analysized through Westen blot. Results he myocardial infarct size of I/R+rhEPO group [（12.32±1.27）%] and I/R+pHBP group [（11.64±2.32）%] were decreased than that of I/R group [（18.45±1.24）%]， the differences were statistically significant （P < 0.05）； the content of LDH and CK-MB in I/R+rhEPO group [（3012.24±175.21）， （216.02±15.24） U/L] and I/R+pHBP group [（2433.24±116.32）， （2511.12±98.72）， （128.16±17.52）， （121.31±21.43） U/L] were decreased than those of I/R group， the differences were statistically significant （P < 0.05）， Compared with I/R group， the expression of p44/42 MAPK in I/R+pHBP group and I/R+rhEPO group were increased at model made 3 hours and 24 hours respectively， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion pHBP has a cadioprotective effect on heart ischemic damage. The protective mechanism may be related to the function of inhibition of myocardial cell apoptosis.
[Key words] Pyroglutamate helix B surface peptide； Ischemia/reperfusion； p44/42 MAPK
近年来随着药物溶栓冠状动脉介入术、冠状动脉旁路移植术等治疗方法的临床应用，使受损心肌得到及时再灌注，明显降低了急性心肌梗死的病死率。但缺血的心肌再灌注时也引起一系列心脏与血管的不良事件[1]，有研究显示，促红细胞生成素（rhEPO）可能发挥潜在的抗心肌细胞凋亡和促进血管新生等作用，从而发挥对缺血再灌注心肌的保护作用。但由于促红细胞生成素同时具有促血小板聚集血栓形成的风险[2]，难以应用于临床。在对促红细胞生成素三级结构研究中发现，促红细胞生成素类似结构、促红细胞生成素B螺旋结构表面缩氨酸（pHBP）是红细胞生成素三级机构中的部分区域结构，分子量为1257，无促血小板聚集作用，保留组织保护结构区域，与组织保护的受体相结合[3-6]。本实验拟探讨pHBP在心肌缺血损伤中是否具有心脏保护作用及可能机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料
取10周左右雄性SD大鼠80只，体重（200±20）g，由南昌大学动物实验中心提供。乳酸脱氢酶（LDH）和肌酸激酶同工酶（CK-MB）检测试剂盒购自武汉亚法生物制品有限公司，重组人红细胞注射液购自沈阳三生有限制药公司，兔抗p44/42 MAPK、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG均购自美国Santa生物公司。pHBP由Araim Pharmaceutical购得。
1.2动物分组及模型建立
参考赵秀梅等[7]的垫扎球囊法制作大鼠缺血再灌注（I/R）模型，实验动物分为4组。假手术组（n=20），丝线穿过冠状动脉左室支但不结扎，经尾静脉注射生理盐水；I/R组（n=20），建立动物模型后5 min后通过尾静脉接受静脉注射注射生理盐水1 mL/kg；I/R+pHBP组（n=20），建立动物模型后5 min后通过尾静脉接受静脉注射pHBP 1 μg/kg；I/R+rhEPO组（n=20），建立动物模型后5 min后通过尾静脉接受静脉注射注射rhEPO 3000 U/kg[8]。
1.3 生化指标检测
I/R 120 min后自腹主动脉取血6 mL，静置30 min，4℃下，以离心半径5 cm，3000 r/min离心10 min，分离血清。按照试剂盒说明采用化学比色法测定血清乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）含量。
1.4 心肌梗死面积测定
存活大鼠在制模24 h后处死，取新鲜大鼠心脏，用PBS缓冲液冲洗，滤纸吸干，-20℃冰冻30 min 后将其横断面切成1～2 mm切片，1% TTC 37℃染色25 min，切片放4%甲醛中过夜以增强颜色对比，非心肌梗死区染色为红色，梗死区不染色。扫描仪扫描心脏切片，使用image proplus 6.0软件测量相关区域面积，梗死面积（%）=左心室组织切片梗死区面积/左心室组织切片总面积×100%。
1.5 Western blot法检测p44/42蛋白表达
手术处理后的存活大鼠在制模后3、24 h进行处死。可以通过组织颜色改变鉴别心肌缺血组织和正常组织，进行组织切片放入液氮冷冻心肌梗死组织标本将通过Western blot方法测定p44/42 MAPK，分别取各组心肌组织，提取总蛋白，收集上清液，考马斯亮蓝法进行担保定量。SDS-PAGE分离样品后电泳转移至硝酸纤维膜上，TBST常温下封闭过夜后，分别加入anti-NF-κB小鼠单抗（一抗）、室温下免疫沉淀1 h，加入加入辣根酶标记兔抗山羊IgG（二抗）2 h。洗膜，显色。具体实验方法参照文献[9]，实验胶片扫描后用Image J软件进行图像分析，以β-actin（1∶1000稀释）作为内参照对比，比值结果表示其蛋白的相对含量，用Gel-ProAnalyzer分析软件分析通道蛋白的灰度值。
1.6 统计学方法
采用SPSS 15.0 统计软件处理。正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组心肌LDH、CK-MB水平的比较
与假手术组比较，I/R组LDH、CK-MB含量明显增加，差异有统计学意义（P < 0.05）。I/R+rhEPO组、I/R+pHBP组LDH、CK-MB含量减少，两组差异无统计学意义（P > 0.05）；与I/R组比较，差异均有统计学意义（P < 0.05），提示pHBP组具有与rhEPO组相似的心肌保护作用。见表1。
表1 各组乳酸脱氢酶、肌酸激酶同工酶水平（U/L，x±s）
注：与假手术组比较，*P < 0.05；与I/R组，#P < 0.05；I/R：缺血再灌注；rhEPO促红细胞生成素；pHBP：促红细胞生成素类似结构；LDH：乳酸脱氢酶；CK-MB：肌酸激酶同工酶
2.2 各组心肌梗死面积情况
假手术组的心肌梗死面积为0.00%，I/R组梗死面积为（18.45±1.24）%，I/R+rhEPO组梗死面积为（12.32±1.27）%，I/R+pHBP组梗死面积为（11.64±2.32）%。与I/R组比较，I/R+rhEPO组和I/R+pHBP组心肌梗死面积均下降，差异均有统计学意义（P < 0.05）；I/R+rhEPO组与I/R+pHBP组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。
2.3 各组心肌组织p44/42 MAPK蛋白表达
Western blot 法检测各组p44/42 MAPK蛋白水平，与I/R组比较，制模3 h I/R+pHBP组心肌梗死组织p44/42 MAPK蛋白表达明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05）；I/R+rhEPO组p44/42 MAPK蛋白表达无明显变化，差异无统计学意义（P > 0.05）。与I/R组比较，制模24 h I/R+rhEPO组心肌梗死组织p44/42 MAPK蛋白表达明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05），I/R+pHBP组p44/42 MAPK蛋白表达无明显变化，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。
表2 各组p44/42 MAPK蛋白表达（ng/L，x±s）
注：与假手术组比较，*P < 0.05；与I/R组比较，#P < 0.05；I/R：缺血再灌注；rhEPO促红细胞生成素；pHBP：促红细胞生成素类似结构；p44/42 MAPK：蛋白激酶丝氨酸/苏氨酸激酶
3 讨论
心肌细胞凋亡在持续缺血或再灌注期间均可出现，且与缺血程度、缺血时间长短等有关。心肌细胞凋亡在缺血再灌注损伤中所起作用越来越引起人们的重视，但确切机制还不清楚，可能与细胞在受到刺激后产生大量氧自由基、细胞内钙超载、线粒体损伤、炎症细胞浸润和基因调控等有关[10-12]。
缺血再灌注损伤引起的心肌细胞死亡有两种机制，即坏死和凋亡，并且凋亡是引起心血管系统疾病的重要原因心肌再灌注虽然恢复了血流，但同时也可能加速了受损心肌细胞的凋亡过程，故细胞凋亡在心肌缺血再灌注损伤的病理过程中发挥着重要的作用。不同时间的心肌缺血/再灌注均有心肌细胞凋亡，而且心肌损伤加重与心肌细胞凋亡增加同时并存，推断细胞凋亡是缺血/再灌注损伤的重要机制。大量实验研究和临床观察日益显示出心肌细胞凋亡，主要是由再灌注启动的现象，但亦有研究表明心肌缺血性损伤也可以诱导心肌细胞凋亡的发生。寻找有效减少心肌细胞凋亡药物，恢复缺血区心肌细胞正常功能 ，已成为心肌缺血再灌注药物研究的重要方面。研究发现pHBP可以减少肾脏缺血再灌注过程中肾小管细胞凋亡抑制冠状动脉粥样硬化病变过程，并且通过激活Akt抑制冠状动脉上皮细胞凋亡[13-14]。本次实验发现在注射pHBP后LDH、CK-MB含量减少，减少心肌损伤，心肌梗死面积下降，与I/R组比较，差异均有统计学意义（P < 0.05），说明其具有促红细胞生成素相似的心脏保护特性，可以改善大鼠心肌缺血再灌注损伤。
丝裂素活化蛋白激酶（MAPK）是一种介导细胞内信号的丝氨酸-苏氨酸激酶，目前，在MAPK超家族中已有3个亚家族被描述，分别为p44/42 MAPK[又称为细胞外信号调节的蛋白激酶（ERK1/ERK2）]、应激激活的蛋白激酶（JNK）和高渗透性甘油反应激酶（p38 MAPK）。其中p44/42 MAPK为脯氨酸导向的丝氨酸/苏氨酸激酶，是最重要的MAPK家族成员，参与调节细胞的有丝分裂和分化，是将信号从细胞膜表面受体转导至核的关键，是细胞因子、生长因子介导细胞增殖效应中重要的途径之一，其活性受到蛋白激酶的磷酸化及蛋白磷酸酶的去磷酸化调节[15-16]。p44/42 MAPK接受上游分子MAPKK（MAPKK inase，MAPK激酶，又称MEK2/MEK1）的磷酸化调控信号后，相邻的酪氨酸和苏氨酸均被磷酸化，从而成为活化形式的p44/42 MAPK。被激活的p44/42 MAPK使胞浆中其他一些酶磷酸化而直接发挥生物学效应；或者转移至细胞核内，并激活一些核内转录因子，使一些转录因子磷酸化从而调节细胞内的基因表达状态，改变基因表达状态从而减少细胞凋亡参与细胞的增殖分化。
p44/42 MAPK具有促进细胞增殖，抗凋亡的作用。Western blot结果发现pHBP和rhEPO组激活了抗凋亡途径，p44/42 MAPK蛋白表达增加。rhEPO组制模处理后24 h p44/42 MAPK蛋白被激活，pHBP制模3 h后激活p44/42 MAPK蛋白被激活，激活效应在24 h内消退。激活时间差异与药物血浆半衰期不同有关[17]。pHBP可以在更短的时间内激活抗凋亡蛋白p44/42 MAPK，减少心肌缺血再灌注损伤。本研究发现，pHBP具有rhEPO相似的心肌缺血再灌注损伤的保护作用，由于其没有抗血小板聚集增加血液流变学及血栓形成的风险，故可以考虑更安全地应用于临床，值得进一步的研究。
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（收稿日期：2014-05-04 本文编辑：苏 畅）