【摘要】 目的：观察血小板单核细胞聚集体（PMA）在全麻手术前后及术后3 d的变化，了解检测PMA对全麻手术前后血栓形成预测的意义。方法：流式细胞术检测112例全麻手术患者手术前、手术后及手术后3 d CD62p、CD63、PMA的表达，比较其在3个不同时间的差异。结果：112例患者麻醉诱导前、手术后、术后3 d CD62p的表达分别为（16.74±9.67）%、（22.76±13.89）%、（20.12±9.83）%；CD63的表达分别为（1.35±0.94）%、（2.26±1.75）%、（1.54±0.81）%；PMA的表达分别为（26.86±5.05）%、（31.86±5.31）%、（77.69±5.72）%；手术后CD62p、CD63、PMA，术后3 d CD62p、PMA与麻醉诱导前比较差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：PMA可以作为评价血小板活化的指标，并且是一种敏感指标，可能在预测血栓形成中有重要意义。
【关键词】 全麻手术； 血小板活化； 血小板单核细胞聚集体； CD62p； CD63
The Importance of the Presentation of PMA in Evaluating the Platelet Activation in Patients with General Anesthesia/WANG Sheng，GUO Fang，CHEN Yuan-chao，et al.//Medical Innovation of China，2013，10（35）：075-077
【Abstract】 Objective： To predict the risk of thrombosis in patients with surgery under general anesthesia by monitoring the platelet-monocyte aggregates（PMA）level before the general anesthesia， immediately after the surgery and 3 days after the surgery. Method： Blood samples were collected from 112 cases of patients with surgery under the general anesthesia before the general anesthesia， immediately after the surgery and 3 days after the surgery. The presentation of CD62p，CD63 and PMA were measured and compared. Result： The presentation of CD62p before the general anesthesia， immediately after the surgery and 3 days after the surgery were （16.74±9.67）%，（22.76±13.89）%，（20.12±9.83）%. The presentation of CD63 were （1.35±0.94）%，（2.26±1.75）%，（1.54±0.81）%， and the presentation of PMA were （26.86±5.05）%，（31.86±5.31）%、（77.69±5.72）%； The presentation of CD62p， CD63 and PMA immediately after surgery and the presentation of CD62p， and PMA 3 days after the surgery compared with before the general anesthesia， the differences were all statistically significant（P<0.05）. Conclusion： PMA is a sensitive biomarker to evaluate the degree of platelet activation and to predict the possible postoperative thrombosis.
【Key words】 General anesthesia； Platelet activation； Platelet-monocyte； CD62p； CD63
First-author’s address： The Anyang Regional Hospital，Anyang 455000，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2013.35.036
血栓栓塞是术后重要的并发症之一，尤其是全麻手术后，极易发生深部静脉血栓（DVT）。血小板是血栓的重要部分，血小板活化与血栓的形成更是存在着密切的关系[1]。P-选择素（CD62p）和溶酶体蛋白（CD63）均为识别活化血小板的分子标志物，CD62p被认为是血小板活化检测的“金标准”。近年来一些研究表明，血小板-白细胞聚集体（PLA），尤其是血小板单核细胞聚集体（PMA）也是血小板活化的敏感指标[2-3]。为探讨他们的关系，笔者观察了112例全麻手术患者的上述指标，现报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选取本院2009年4月-2011年12月全麻手术患者112例，其中男52例，女60例，年龄20～78岁，平均55.8岁。外科肿瘤患者46例（胃癌19例，结肠癌27例），骨科骨折患者及关节置换患者38例，妇科患者28例（乳腺癌11例，子宫肌瘤7例，子宫颈癌10例）。手术时间90～180 min。
1.2 主要试剂与仪器 鼠抗人CD62p-PE，鼠抗人CD63-FITC，同型对照（鼠IgG-FITC和鼠IgG-PE），由BD公司提供；鼠抗人CD41-FITC，鼠抗人CD61-PE，鼠抗人CD45-pc5，由美国beckman coulter公司提供，溶血素为自配甲酸溶血素，流式细胞仪为Coulter EPICS XL（Beckman coulter 公司）。
1.3 标本采集 分别于患者手术麻醉诱导前，手术结束及手术后3 d采集标本进行CD62p、CD63和PMA检测。
1.4 实验方法
1.4.1 CD62p检测 取抗凝全血500 r/min，离心5 min，取上层富血小板血浆，用PBS调整血小板数为100×109～200×109/L，备用。在两支流式试管中均加入10 μL鼠抗人CD41-FITC后，其中1支试管加入10 μL鼠IgG PE作为同型对照管，另1支试管加入10 μL鼠抗人CD62p-PE作为测试管，分别加入50 μL富血小板血浆，混匀。室温避光孵育20 min后，用1 mL PBS缓冲液洗涤1次，离心，弃去上清。然后，加入500 μL PBS缓冲液混匀后置流式细胞仪上进行检测。
1.4.2 CD63检测 取抗凝全血500转/min，离心5 min，取上层富血小板血浆，用PBS调整血小板数为100×109～200×109/L，备用。在两支流式试管中均加入10 μL鼠抗人CD61 PE后，其中1支试管加入10 μL鼠IgG FITC作为同型对照管，另1支试管加入10 μL鼠抗人CD63 FITC作为测试管，分别加入50 μL富血小板血浆，混匀。室温避光孵育20 min后，用1 mL PBS缓冲液洗涤1次，离心，弃去上清。然后，加入500 μL PBS缓冲液混匀后置流式细胞仪上进行检测。
1.4.3 PMA检测 在两支流式试管中均加入5 μL鼠抗人CD45pc5后，其中1支试管加入10 μL鼠IgG1 FITC作为同型对照管，另1支试管加入10 μL鼠抗人CD41 FITC 作为测试管，分别加入50 μ LEDTA抗凝全血，混匀。室温避光孵育20 min后，用甲酸溶血素溶血，PBS缓冲液洗涤1次。然后，加入500～1000 μL PBS缓冲液混匀后置流式细胞仪上进行检测。
1.5 流式分析 （1）分别以CD41和CD61设门，圈定血小板（图1和图3），以同型对照分别设定CD62p和CD63阴性界限，观察血小板上CD62p和CD63的表达百分率（图2和图4）。（2）利用CD45和SS散射光参数，可以将外周血细胞分为中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞3群（图5）。CD41抗原也称为血小板gpⅡb，是一种血小板上的特异性膜糖蛋白标记，如果单核细胞上显示有CD41，说明单核细胞上黏附有血小板，称为PMA，以百分比表示，以同型对照管设定PMA阴性细胞界限，可以用单参数图或散点图显示PMA的表达（图6和图7）。
1.6 统计学处理 采用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
112例全麻手术患者血小板的CD62p、CD63和PMA的表达结果见表1。
表1 112例患者血小板的CD62p、CD63和PMA的表达结果 %
项目麻醉诱导前手术结束后术后3 d
CD62p（n=112）16.74±9.6722.76±13.89*20.12±9.83*
CD63（n=112）1.35±0.942.26±1.75*1.54±0.81
PMA（n=112）26.86±5.0531.86±5.31*77.69±5.72*
*与同项目麻醉诱导前比较，P<0.05
3 讨论
血栓栓塞是术后重要的并发症之一，近30年来，术后肺梗塞的死亡率明显上升，远远超出人们的估计。据美国1986年发表的资料，骨科手术时，其深静脉血栓（DVT）的发生率达45%～70%，其中3%可引起致命的肺栓塞[4]。妇科手术为7%～45%，平均19%。手术类型、麻醉方式等因素均可明显影响术后DVT的发生，尤其是全麻手术后，极易发生深部静脉血栓。血小板是血栓的重要部分，血小板活化与血栓的形成更是存在着密切的关系[1]。研究表明，血小板和白细胞分别活化后，其表面的黏附分子增加，黏附分子通过配体相互结合和/或通过纤维蛋白原在黏附分子之间的桥接作用形成PLA。PLA尤其是血小板-单核细胞聚集体（PMA）可以作为评价血小板活化的指标。CD62p又称颗粒膜蛋白（GMP-140），它分布于静止血小板的a颗粒中，当血小板受到凝血酶及组胺的激活时，CD62p能很快从血小板内转移到其表面的浆膜上，是反映血小板活化的可靠指标。CD62p的主要作用是介导血管内皮细胞和炎性细胞的黏附及激活的血小板和炎性细胞的黏附。CD63也称溶酶体膜蛋白（GP53），是存在于血小板溶酶体颗粒的膜糖蛋白，它能在活化的血小板膜表达。CD63能够传送中性粒细胞的活化信号，促进中性粒细胞黏附于内皮细胞，这种信号传导作用可能是通过血小板或其它细胞表面CD63与整合素特异结合而实现的[5]。在血栓形成的急性期，黏附的血小板释放其颗粒内容物，其内容物本身就是强大的促血小板激活物，不仅能激活已形成血栓的血小板，而且对流经此处未黏附的血小板也具有激活作用[6]。所以，CD62p和CD63均为识别活化血小板的分子标志物，CD62p更是被认为是血小板活化检测的“金标准”。
本文对112例全麻手术患者的CD62p、CD63和PMA术前术后变化分析发现，112例全麻手术患者麻醉诱导前其血小板CD62p的表达为（16.74±9.67）%，手术结束后为（22.76±13.89）%，术后3 d为（20.12±9.83）%，与手术前相比，差异均有统计学意义（P<0.05）。术后3 d其均值已有所降低，但还没有恢复到手术前的均值水平。手术麻醉诱导前CD63的表达为（1.35±0.94）%，手术后为（2.26±1.75）%，差异有统计学意义（P<0.05）。手术后3 d CD63的表达为（1.54±0.81）%，与手术前比较，差异无统计学意义（P<0.05），但其均值仍高于术前的水平；手术麻醉诱导前，其PMA为（26.86±5.05）%，手术结束后为（31.86±5.31）%，差异有统计学意义（P<0.05）。手术后3 d PMA的表达为（77.69±5.72%），与术前比较，差异有统计学意义（P<0.05），且其均值仍高于术后的水平。全麻手术对患者的血小板活化状态有明显的影响，但对各种活化指标具有不同的影响。P-选择素（CD62p）一般被认为是血小板活化的“金标准”，本文观察的结果，其变化明显。CD63在手术后有明显的变化，可能CD63在血小板活化状态中表达的比CD62p更敏感。PMA的表达，无论是术后还是术后3 d，其变化均有极显著性差异，这也证实了Michelson等[7]的观点，PMA可以作为评价血小板活化的指标，与P-选择素相比是一种更加敏感的指标。流式细胞术检测PMA可能在血栓栓塞性疾病的预测、预后等方面发挥重要作用。
参考文献
[1]王振义，李家增，阮长庚.血栓与止血基础理论与临床[M]. 第2版. 上海：上海科学技术出版社，1996：378-379.
[2] Micheson A D， Barnard M R， Krueger L A， et al. Circulating monocyte-platelet aggregates are a more sensitive marker of in vivo platelet activiation than platelet surface P-selectin[J]. Circulation， 2001， 104（14）： 1533.
[3] Ritter L S， Stempel K M， Coull B M，et al. Leukocyte-platelet aggregates in rat peripheral blood after ischemic stroke and reperfusion[J]. Biol Res， 2005， 6（2）： 281.
[4] Arthur E Baue M D. Preventiong of venous thrombosis and pulmonary embolism[J].JAMA， 1986， 256（6）：757.
[5] Metzelaar M J，Wijngaard P L，Peters P J，et a1.CD63 antigen-A novel lysosomal membrane glycoprotein， cloned by a screening procedure for intracellular antigens in eukaryotic cells[J].J Biol Chem， 1991， 266（5）： 3239-3245.
[6] Ruggeri Z M.Mechanisms of shear-induced platelet adhesion and aggregation[J].Thromb Haemost， 1993， 70（1）： 119-123.
[7] Michelson A D. Furman M I. Laboratory marker of platelet activation and their cilinical significance[J]. Curr Opin Hematol， 1999， 6（5）： 342-348.
（收稿日期：2013-07-01） （本文编辑：黄新珍）