[摘要] 目的 探讨IDO/TTS介导的色氨酸代谢途径在免疫性血小板减少症患者发病及治疗中的作用。 方法 选取2016年9月～2017年9月来我院就诊的30例免疫性血小板减少症患者（观察组）和同期来我院体检的30例健康者（对照组）为研究对象，观察组患者给予地塞米松进行治疗，采集治疗前后血液样本，比较分析血浆中Kyn、Trp、 Kyn/Trp的水平，以及CD4+、CD8+T 淋巴细胞中TTS、IDO的表达。 结果 治疗前，观察组Kyn、Trp以及Kyn/Trp水平均高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；治疗后，有效组患者血浆中Trp水平降低，Kyn、Kyn/Trp水平升高，差异有统计学意义（P<0.05）；治疗前，观察组CD4+、CD8+T 淋巴细胞中IDO水平显著高于对照组，TTS水平显著低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；治疗后，有效组患者CD4+、CD8+T 淋巴细胞中IDO水平水平升高，TTS水平降低，差异有统计学意义（P<0.05）；治疗无效组患者治疗前后各项指标无显著差异（P>0.05）。 结论 IDO/TTS介导的色氨酸代谢途径与免疫性血小板减少症患者的发病相关，也可通过IDO/TTS评价患者的临床疗效，具有指导意义。
[关键词] IDO；TTS；色氨酸；免疫性血小板减少症
[中圖分类号] R558.2 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2018）17-0118-04
Exploration of the effect of IDO/TTS-mediated tryptophan metabolic pathway in the pathogenesis and treatment of immune thrombocytopenia
ZHOU Jun YUAN Yuan
Clinical Laboratory， Taizhou Hospital in Zhejiang Province， Linhai 317000， China
[Abstract] Objective To investigate the effect of IDO/TTS-mediated tryptophan metabolic pathway in the pathogenesis and treatment of immune thrombocytopenia. Methods 30 patients with immune thrombocytopenia（observation group） who came to our hospital from September 2016 to September 2017 and 30 healthy people（control group） who had physical examination in our hospital during the same period were selected as the study subjects. Patients in the observation group were treated with dexamethasone， and the blood samples before and after treatment were collected. The levels of Kyn， Trp， Kyn/Trp in the plasma， and the expressions of TTS and IDO in CD4+ and CD8+ T lymphocytes were analyzed and compared. Results Before treatment， the levels of Kyn， Trp and Kyn/Trp in the observation group were higher than those in the control group， and the difference was statistically significant（P<0.05）； after treatment， the Trp level was decreased in plasma in the effective group. The levels of Kyn and Kyn/Trp were increased， and the difference was statistically significant（P<0.05）； before treatment， IDO levels in CD4+ and CD8+ T lymphocytes in the observation group were significantly higher than those in the control group. The level of TTS was significantly lower than that in the control group， and the difference was statistically significant（P<0.05）； after treatment， IDO levels in the CD4+ and CD8+T lymphocytes in the effective group were increased， and the level of TTS was decreased. The differences were statistically significant（P<0.05）； there was no significant difference in each index before and after treatment in the ineffective treatment group（P>0.05）. Conclusion The IDO/TTS-mediated tryptophan metabolic pathway is associated with the onset of immune thrombocytopenia. IDO/TTS can also be used to evaluate the clinical efficacy of patients， with guiding significance.
[Key words] IDO； TTS； Tryptophan； Immune thrombocytopenia
原发免疫性血小板减少症（immune thrombocytopenia，ITP）[1，2]，既往称特发性血小板减少性紫癜，属于获得性自身免疫性疾病之一[3]。目前认为ITP的发病机制是由于患者体内T淋巴细胞异常活化，B淋巴细胞被激活[4，5]，患者对自身血小板抗原免疫失耐受，产生针对自身血小板抗原的免疫性抗体，通过体液免疫、细胞免疫，导致患者体内血小板的过度破坏和生成受抑，血小板减少，伴或不伴皮肤黏膜出血，是临床常见的出血性疾病之一[6]。色氨酸（tryptophan，Trp）是细胞生长代谢过程中的必需氨基酸，参与多种组织器官的代谢，吲哚胺2，3-双加氧酶（ndoleam-ine2，3-dioxygenase，IDO）是Trp沿犬尿氨酸（kynurenine，Kyn）代谢的关键酶[7]，而当Trp浓度降低时，可抑制T淋巴细胞的增殖。目前，临床上对于ITP主要给予地塞米松进行治疗[8，9]，本研究通过观察健康人和ITP患者，以及ITP患者治疗前后血浆中Kyn、Trp、Kyn/Trp的水平，以及CD4+、CD8+ T淋巴细胞中TTS、IDO的表达，旨在探讨IDO/TTS介导的色氨酸代谢途径在免疫性血小板减少症患者发病及治疗中的作用[10]。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2016年9月～2017年9月来我院就诊的30例免疫性血小板减少症患者和同期来我院体检的30例健康人为研究对象，其中免疫性血小板减少症患者为观察组，健康体检者为对照组。其中，观察组男13例，女17例；年龄12～67岁，平均（32.8±4.0）岁。对照组男14例，女16例；年龄11～68岁，平均（32.6±4.1）岁。纳入标准：所有观察组患者均符合《血液病诊断及疗效标准》[11]中原发免疫性血小板减少症的诊断标准，其中血小板为（0～59）×109/L，血小板平均计数为（16.8±2.0）×109/L。排除标准：①伴有其他自身免疫性疾病患者；②糖尿病、高血压等慢性疾病患者；③肺结核、消化性溃疡、肝炎等感染性疾病；④近1个月内无糖皮质激素或免疫抑制剂治疗史。两组患者在性别、年龄等一般资料上比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2 治疗方法
观察组患者给予40 mg/d地塞米松（广西万德药业股份有限公司，国药准字：H20113234，规格：5 mg/1 mL）+200 mL生理盐水中静滴，疗程为4 d[12]，采集健康体检者以及治疗前和治疗后5 d免疫性血小板减少症患者的肝素血液样本。
1.3 疗效判定标准
根据患者的临床疗效结果，分为完全缓解、有效、无效三个等级，完全缓解：患者无出血，且血小板计数≥100×109/L；有效：患者无出血，且血小板计数≥30×109/L或增加2倍；无效：患者有出血或血小板计数<30×109/L。临床有效率=（完全缓解例数+有效例数）/总病例数×100%[10]。
1.4 处理方法
1.4.1 液相-质谱联用分析 通过液相-质谱联用分析系统（LC-MS/MS）比较分析血浆中犬尿氨酸（Kyn）、色氨酸（Trp）的浓度以及Kyn/Trp的比值。具体方法为：将经抗凝处理后的100 μL血浆样品加入200 μL乙腈中，涡旋混匀，静置，以14000 r/min的速度離心30 min，取上清，加入色谱柱内进行分析。设置流速度为0.2 mL/min，其中，流动相A相为乙腈：水=5：95；流动相B相：乙腈：水=95：5（A、B相均含0.1%的甲酸）。
1.4.2 流式细胞仪分析 通过流式细胞仪比较分析CD4+、CD8+T淋巴细胞中色氨酰-tRNA合成酶（TTS）、吲哚胺2，3-双加氧酶（IDO）的表达。具体方法为：取10 mL的肝素抗凝血，分离外周单个核细胞，调整细胞浓度为5×105个/mL，加入固定剂，涡旋混匀固定，每管中各加入5 μL抗体，4℃避光孵育30 min。加入500 μL的固定剂，室温涡旋混匀固定后PBS洗涤。加入200 μL破膜剂，以1500 r/min的速度离心15 min，弃上清。每管加4 μL的IDO抗体，及5 μL的TTS抗体，室温避光孵育。再次加破膜剂、PBS洗涤后重悬细胞，加5 μL二抗，4℃避光孵育，将处理好的样品加入BD CantoⅡ流式细胞仪中检测CD4+、CD8+T淋巴细胞中TTS、IDO的表达，通过FACS Diva7.0软件进行结果分析，以荧光强度来评价CD4+、CD8+T淋巴细胞中TTS、IDO的表达水平。
1.5 统计学处理
采用SPSS13.0软件进行数据分析。计量资料以（x±s）表示，采用t检验；计数资料采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 观察组患者临床疗效情况
经地塞米松治疗后，免疫性血小板减少症患者中15例完全缓解，8例有效，7例无效，患者的临床有效率为76.67%。
2.2 治疗前后血浆Kyn、Trp以及Kyn/Trp水平情况比较
治疗前，观察组Kyn、Trp以及Kyn/Trp水平均高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；治疗后，有效观察组患者血浆中Trp水平降低，Kyn、Kyn/Trp水平升高，差异有统计学意义（P<0.05），无效观察组患者血浆中Kyn、Trp以及Kyn/Trp水平无显著差异（P>0.05）。见表1。
2.3 治疗前后CD4+、CD8+T淋巴细胞中IDO、TTS的表达水平情况
治疗前，观察组CD4+、CD8+T淋巴细胞中IDO水平显著高于对照组，TTS水平显著低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；治疗后，有效观察组患者CD4+、CD8+T淋巴细胞中IDO水平水平升高，TTS水平降低，差异有统计学意义（P<0.05）；治疗无效观察组患者治疗前后CD4+、CD8+T淋巴细胞中IDO、TTS水平无显著差异（P>0.05）。
3 讨论
免疫性血小板减少症（ITP）是一种淋巴细胞介导的出血性疾病[13，14]，其发病机制尚未完全明确，早期大多数学者倾向于是由于患者的体液免疫，患者体内产生过多的血小板抗体，导致血小板的过多破坏[15，16]，而近年来，学者们更倾向于是由于患者细胞免疫，其自身的CD4+T淋巴细胞是触发患者体内血小板自身免疫应答的关键，而CD8+T淋巴细胞介导的细胞毒性，导致患者血小板的破坏增加，加重疾病。色氨酸（tryptophan，Try）是细胞生长代谢的必需氨基酸，犬尿氨酸途径是Try最主要的代谢途径，人体内约95%的Try经此途径代谢，Try在吲哚胺-2，3-双加氧酶（Indoleam-ine2，3-dioxygenase，IDO）的作用下生成甲酰犬尿氨酸，后者迅速在犬尿氨酸甲酰胺酶的作用下生成犬尿氨酸（Kynurenine，Kyn）。IDO是含亚铁血红素的单肽链[17]，是Trp代谢的关键酶和限速酶[18]，Trp是细胞维持正常生理功能必不可少的氨基酸之一，IDO介导的色氨酸代谢在调节T细胞介导的免疫应答和感染中发挥着重要作用。研究发现，当Trp浓度降低时，细胞的增殖受到抑制，细胞处于静止期，阻断T淋巴细胞的免疫应答。TTS能够催化Trp与其结合，增加细胞内Trp的储备，调节Trp的代谢过程，调控免疫应答[19]。IDO和TTS通过参与Trp代谢过程而参与多种自身免疫性疾病的调控，Kyn/Trp值是IDO活性的评估标准。目前临床上对于ITP缺乏特异性的治疗方法，常用的治疗方案包括糖皮质激素、免疫抑制剂、人免疫球蛋白、促血小板生成素等。地塞米松是目前临床上公认的用于治疗免疫性血小板减少症的药物，其疗效显著、起效时间短、副作用少等优点[20，21]。ITP患者存在IDO和TTS表达的异常，地塞米松治疗对IDO/TTS代谢途径是否有影响，未见相关报道。
本研究中，选取2016年9月～2017年9月来我院就诊的30例免疫性血小板减少症患者和同期来我院体检的30例健康者为研究对象，其中免疫性血小板减少症患者为观察组，健康体检者为对照组，观察组患者给予地塞米松进行治疗，采集健康体检者以及治疗前和治疗后5 d免疫性血小板减少症患者的血液样本，通过液相-质谱联用分析系统（LC-MS/MS）比较分析血浆中犬尿氨酸（Kyn）、色氨酸（Trp）的浓度以及Kyn/Trp的比值，通过流式细胞仪比较分析CD4+、CD8+T淋巴细胞中色氨酰-tRNA合成酶（TTS）、吲哚胺2，3-双加氧酶（IDO）的表达。结果显示：治疗前，观察组Kyn、Trp以及Kyn/Trp水平均高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；治疗后，有效组患者血浆中Trp水平降低，Kyn、Kyn/Trp水平升高，差异有统计学意义（P<0.05）；治疗前，观察组CD4+、CD8+T淋巴细胞中IDO水平显著高于对照组，TTS水平显著低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；治疗后，有效组患者CD4+、CD8+T淋巴细胞中IDO水平水平升高，TTS水平降低，差异有统计学意义（P<0.05）；治疗无效组患者治疗前后血浆Kyn、Trp、Kyn/Trp水平，以及CD4+、CD8+T淋巴细胞中IDO、TTS水平无显著差异（P>0.05）。
综上所述，IDO/TTS介导的色氨酸代谢途径与免疫性血小板减少症患者的发病相关，也可通过IDO/TTS评价患者的临床疗效，具有指导意义。
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（收稿日期：2018-01-31）