[摘要] 随着新型免疫抑制剂的临床应用和血管吻合技术的提高,临床肝移植成功率大大提高，而严重肝脏缺血再灌注损伤所引起的移植肝功能受损始终未能解决，影响肝移植的效果。因此本文对肝脏缺血再灌注损伤的分类、机制、预防及治疗等方面予以综述。
[关键词] 肝脏；局部缺血；再灌注损伤
[中图分类号] R657.3[文献标识码]C [文章编号]1674-4721（2009）05（a）-020-03
The mechanism of hepatic ischemia-reperfusion injury
GUAN Bingxing, GU Mei
(Beijing Tongren Hospital General Surgery,Beijing100730,China)
[Abstract] With the new immunosuppressive agents and the clinical application of vascular anastomosis techniques improved the success rate of clinical liver transplantation greatly improved. And severe hepatic ischemia-reperfusion injury caused by impaired liver function has not yet been resolved, the effect of the impact of liver transplantation. So this article on hepatic ischemia-reperfusion injury classification, mechanism, prevention and treatment to be summarized.
[Key words] Liver；Ischemic；Reperfusion injury
肝移植相关的缺血再灌注损伤是指从正常体温下，心脏停跳开始到供肝植入受体内，重新建立起血循环的全过程中，在任何时间和任何环节发生的肝细胞损伤。热缺血损伤指的是肝脏在正常体温下心脏停跳到冷灌注开始的这段时间发生的损伤；冷缺血损伤指的是肝脏在低温下缺血引起的损伤；再灌注损伤是肝脏在缺血后，恢复血液供应不仅不能使肝功能恢复，反而肝脏损伤加重的现象。缺血性损伤和再灌注损伤是密切相连的病理生理过程，不能把两者区分开来，是连续的过程。本文为了叙述方便，分别描述各自的病理生理变化。
移植肝缺血再灌注损伤包括热缺血、冷缺血及再灌注损伤三个过程。其形成因素是不同温度下肝脏缺血所致。热缺血损伤程度主要与热缺血的时间长短相关；冷缺血损伤程度则与冷保存时间长短相关。因此肝移植相关的缺血再灌注损伤程度与冷热缺血时间长短相关。
肝脏缺血再灌注损伤病理生理学机制：缺血性损伤和再灌注损伤是密切相连的病理生理过程，不能把两者区分开来，是个连续的过程。但为了方便，本文将分别叙述在各阶段发生的变化，其中再灌注期的损失占主要地位。主要表现在血液再灌注后因迅速纠正缺血、缺氧及酸中毒情况导致大量氧自由基释放、Ca2+超载以及多种有害因子的释放导致移植物损伤。
1 热缺血损伤机制
肝脏在正常体温下心脏停跳到冷灌注开始的这段时间叫热缺血时间，这段时间的长短极大的影响了移植后肝功能的恢复。各个器官耐受热缺血时间的长短有所不同，根据动物实验的结果推测，热缺血15～20 min为比较安全的时限[1]，但临床上有用热缺血达30 min肝脏移植后肝功能恢复良好的患者，但已达成的共识是这段时间越短对移植肝脏术后肝功能恢复越好。热缺血期的病理生理变化及其可能机制：
1.1代谢性酸中毒
肝脏在常温下即热缺血时，各种代谢底物和氧的供应中止，细胞内储存的能量很快耗尽，无氧酵解的发生和肝细胞内ATP 迅速耗尽，导致乳酸、酮体等的堆积以及线粒体氧化磷酸化功能低下，引发代谢性酸中毒，pH 值降低，但pH 值降低抑制了磷脂酶、蛋白水解酶等pH 依赖性酶类活性，减少其对细胞的损伤，从而能保护肝细胞和其他细胞免于坏死。
1.2 线粒体损伤
线粒体是细胞氧化磷酸化反应的主要部位，肝脏热缺血时ATP含量减少，Ca2+进入线粒体增多，使线粒体功能受损，细胞色素氧化酶系统功能失调，以致进入细胞内的O2 经单电子还原而形成的氧自由基增多。在机体内氧自由基可对蛋白质、脂肪及核酸等几乎所有生物活性物质均具有损伤作用[2]。
1.3钙超载
正常生理条件下，细胞内外Ca2+浓度存在着较大的梯度，细胞内低的Ca2+浓度是维持细胞正常生理机能的前提，各种原因引起的细胞内钙含量异常增多并导致细胞结构受损和功能代谢障碍的现象称为钙超载。缺氧使ATP 含量下降，导致肝细胞内外Ca2+重新分布，即Ca2+内流。钙超载引起肝损伤的机理有以下几个方面，细胞内高浓度Ca2+可促使黄嘌呤脱氢酶向黄嘌呤氧化酶转化，从而为氧自由基的产生提供了催化剂。Kupffer 细胞的钙超载是其被激活的根本原因，激活的Kupffer 细胞可通过释放大量毒性介质而参与或介导肝脏损伤[3-4]。
以上的缺血损害在一定时间内是可逆的，但超过一定限度将导致不可逆损害。35～37℃下器官能耐受的热缺血时间极短，故降低温度是成功保存器官的关键。
2 冷缺血（保存）损伤机制
供体器官经低温灌注降到一定的温度后，还必须经历一个冷缺血保存过程才能进行移植。不同器官可耐受的缺血时间也不同。影响器官保存的因素很多：包括保存液的配方、渗透压的高低、器官的降温、维持和恢复以及器官的保存方式等。低温可延长组织的存活时间，是保存成功的关键因素，但同时低温也会对器官组织的正常功能产生很大影响。主要机制如下：低温抑制ATP酶的活性，胞质膜电位差降低，Ca2+通过质膜通道、Na+-Ca2+交换，膜通透性改变顺离子浓度梯度等方式内流进入细胞。低温致ATP消耗，线粒体、内质网钙泵失活，释放出大量Ca2+，发生细胞内有害的Ca2+再分配，同时低温无氧糖酵解产生乳酸堆积，细胞内酸中毒使钙蛋白结合的钙游离为Ca2+，胞质和线粒体中钙超载，破坏了线粒体的结构和功能，氧化磷酸化功能丧失，ATP合成障碍，胞内钙超载可激活磷脂酶C、磷脂酶A2，破坏膜磷脂，还可激活蛋白酶，促使黄嘌呤脱氢酶（XD）转化为黄嘌呤氧化酶（XO），再灌注时产生氧自由基加剧细胞损伤。主要作用目前认为在冷保存期间肝脏的主要变化包括细胞水肿，氧自由基、溶酶体酶等有害因子的释放， 细胞内Na+、Ca2+超载。这些因素共同导致冷缺血期肝细胞的损伤[1]，见图1。
3再灌注损伤机制
再灌注损伤与自由基的产生，钙超载的作用，中性粒细胞的聚集，内皮素（ET）/ 一氧化氮（NO）的失衡，核因子-κB (NF-κB) 的激活，前炎性细胞因子(proinflammatory cytokine) 和黏附因子的释放等因素密切相关。其中氧自由基的损害作用最大，将分别予以阐述。
3.1 氧自由基
氧自由基是一种由O2诱发的在外层电子轨道上含有单个未配对电子的化学物质，其具有高度不稳定性，它们包括超氧化物自由基、过氧化氢、氢氧根，主要来源于细胞质黄嘌呤氧化酶、Kupffer 细胞、黏附的中性粒细胞。在机体内氧自由基可对蛋白质、脂肪及核酸等几乎所有生物活性物质均具有损伤作用。
再灌注时主要通过以下途径激发氧自由基。①黄嘌呤氧化酶系统: 细胞缺血低氧时，由于能量代谢障碍，造成细胞内Ca2+浓度增高，进而活化钙依赖蛋白酶，后者可催化黄嘌呤脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶，再灌注时黄嘌呤氧化酶促使次黄嘌呤分解为尿酸的同时而产生氧自由基。②吞噬细胞系统:激活的Kupffer 细胞及黏附于肝窦内的白细胞可产生膜相关的NADPH 氧化酶，后者可将胞浆内的HADPH 氧化成NADP+，并将产生的3个电子传递给氧，从而生成超氧化物基团。③线粒体呼吸链:正常生理下，细胞内线粒体呼吸链能产生微量的超氧化物基团及H2O2，但细胞的缺血低氧可放大线粒体的这种功能， 从而产生大量的超氧化物[5]。
氧自由基的主要损伤作用在于：①细胞膜双层脂质进行氧化产生脂质过氧化物（LPO），直接损伤细胞；②损伤细胞器膜，引起细胞器破裂；③引起细胞损伤，释放各种酶及细胞因子，细胞因子可以接到中性粒细胞在血管内皮素聚集黏附，造成微循环障碍。氧自由基可氧化浆膜，改变膜的流动性和通透性，氧化含巯基的酶而使酶失活，氧化核酸，使DNA双链断裂，脂质过氧化产生血小板激活因子（PAF）、白三烯、血栓素和前列腺素等炎性介质和TNF、IL-1、IL-6等细胞因子，加剧内皮细胞损伤，并趋化血小板、白细胞黏附、聚集，血液凝集性增高，导致组织损伤进一步加重[1]。
3.2 中性粒细胞
中性粒细胞在肝脏缺血再灌注损伤的早期聚集到肝脏微循环系统中被活化，加重再灌注损伤。中性粒细胞的聚集外侵需要肝窦内皮细胞和中性粒细胞之间的相互作用，通过中性粒细胞和内皮细胞表面黏附分子（ICAM-1）的上调使得两者的结合更加紧密，从而使中性粒细胞进一步越过内皮细胞，转入肝脏实质，产生炎症反应；另一方面，中性粒细胞黏弹性较大，流经微循环所需时间较长，缺血再灌注压下降，中性粒细胞可以堵塞微血管造成无复流现象。有研究认为，肝窦是中性粒细胞外侵的主要地方，一旦外侵入肝实质，中性粒细胞通过淋巴细胞相关抗原与肝细胞上的细胞间黏附分子结合发生作用，引起长时间的蛋白酶的释放和氧化应激，造成肝脏的损伤[5]，损伤的内皮可吸引中性粒细胞及血小板，促进其释放化学趋化介质如白三烯、B4、PAF等，进一步促进黏附，造成毛细血管堵塞和无复流。
3.3 Kupffer 细胞
Kupffer 细胞是位于肝血窦内的巨噬细胞，肝脏缺血再灌注后Kupffer 细胞可被激活，该细胞被激活后产生氧自由基和大量炎症介质,其中以TNF和IL-1作用最强。它们可直接造成肝细胞和肝窦内皮细胞的损伤，最重要的作用在于其介导的链式损伤反应：①引起肝窦内皮细胞的损伤，刺激肝窦内皮细胞黏附分子高表达；②刺激肝窦内皮细胞合成和释放一氧化氮和内皮素；③激活中性粒细胞释放氧自由基，中性粒细胞在黏附分子的作用下与血管内皮黏附聚集，引起内皮细胞进一步损伤和肝脏微循环障碍；④介导肝细胞产生多核中性粒细胞化学趋化因子，最中性粒细胞在肝组织中游走和损失肝细胞起重要作用。有研究表明，在肝缺血再灌注损伤中，Kupffer细胞被激活产生细胞因子引起的链式损伤反应，从不同环节进行阻断可以减轻和预防肝损伤[6]。
3.4细胞因子
多种细胞因子参与了肝脏缺血再灌注损伤的病理生理过程，例如TNF-α、PAF (血小板激活因子)、IL-1 、IL-10 等。这些细胞因子可以通过自分泌、旁分泌以及体液途径在肝内彼此间形成网络、协同作用，进而引起肝损伤。TNF-α作用在于：①可激活T、B 淋巴细胞并增强它们的细胞毒性作用，又可诱导和上调细胞间细胞黏附分子和血管细胞黏附分子，从而促进白细胞与血管内皮细胞的黏附。②加强内皮细胞MHCI 类抗原的表达，促使血管内皮细胞产生PAF、IL-1 等炎性介质，并激活白细胞，促进血栓形成。③间接损害线粒体并可激发Kupffer 细胞产生过氧化物残基，诱导巨噬细胞释放IL-1、IL-6 、IL-8 等细胞因子，加重再灌注后移植肝损害[7] 。IL-1可诱导IL-8的合成并增加细胞黏附分子选择素、整合素的表达，这些均增强中性粒细胞与内皮细胞的黏附，进一步导致合成更多的细胞因子；PAF 可激活黏附于肝窦内皮细胞上的中性粒细胞产生大量的氧自由基。IL-10 是一种抗炎细胞因子，它可以通过抑制NF-κB 的活性减轻炎症反应。研究发现，IL-10 能抑制TNF-α及细胞黏附分子的表达，从而减轻肝脏缺血再灌注损伤导致的微循环障碍。
3.5一氧化氮(NO) 和内皮素( ET)
再灌注时NO 和ET 水平失衡是肝脏再灌注损伤的一个重要因素。NO 是由血管内皮细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等多种细胞分泌的介质。①它舒张血管能直接影响机体特异和非特异性免疫，尤其在器官移植缺血再灌注损伤中，引起具有调节血管张力、调节微循环、抑制血小板聚集，抑制白细胞的粘附的作用[8-9]。②与O2结合成过氧亚硝酸盐释放自由基，引起肝细胞和内皮细胞损伤。ET是一种来源于内皮细胞并具有广泛生物学活性的多肽类物质，它可以通过激活磷脂酶及细胞膜离子通道从而收缩血管，血管收缩效应对ET 具有剂量依赖性，在肝脏缺血再灌注过程中，肝窦内皮细胞合成及分泌ET 的能力明显增强。这可能是因为一方面低氧及胞浆内Ca2+浓度升高可促使内皮细胞产生ET，另一方面在再灌注短期内，由门静脉进入肝脏内的肠源性内毒性也可刺激内皮细胞产生ET。研究发现，肝脏再灌注时期ET 浓度显著增高而NO浓度则明显降低，二者浓度失衡是肝脏缺血再灌注损伤微循环障碍的一个重要原因[10]。应用内皮素受体阻滞剂可使缺血再灌注损伤减轻。
4前景
为了延长移植器官存活期，基因治疗主要起两方面的作用：①抑制排斥免疫反应；②增强移植器官保护功能。主要作用在第一方面，但这种机制也包括一些非免疫机制，这些非免疫机制是缺血再灌注后局部炎性反应和随后组织修复的结果。它包括两个方面：①抗氧化应激反应移植细胞或器官早期非免疫性失活的一个重要原因是缺氧和再灌注损伤，缺血再灌注损伤激起氧自由基的产生。氧自由基会引起细胞因子的生成和白细胞聚集，导致移植器官细胞死亡。氧化应激还增加移植器官随后发生急性和慢性排斥反应的机会。最近已经用转基因的方法在肝脏中证实了氧化应激在器官移植缺血再灌注损伤中的作用。在这个研究中，用腺病毒做转基因载体使肝细胞产生大量表达线粒体超氧化物歧化酶，减少了缺血再灌注后干细胞的损伤。这和移植了氧化还原反应激活NF-κB和AP1转录因子有关。这些结果说明了将抑制氧化还原反应的分子转入移植器官可以预防移植器官失活。②抗凋亡基因。在器官移植基因工程中，让移植器官大量表达抗凋亡基因是个突破口。这不但包括防止发生于缺血再灌注损伤后的凋亡，而且减少潜在疾病或排斥免疫机制造成的移植器官实质细胞死亡。在肝脏缺血再灌注损伤模型中腺病毒转Bcl-2基因防止了肝细胞损伤和凋亡。在体外实验中，内皮细胞表达抗凋亡基因（Bcl-2，Bcl-xl和A20），不但可以防止凋亡，还可以抑制它们被依赖于核因子κB的机制激活。NF-κB介导细胞因子和氧自由基对内皮细胞的激活，导致许多炎性前介质的产生，损害移植器官功能。
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(收稿日期：2009-04-08)